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苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,简称Bt)为革兰氏阳性菌,由于它可在不同生长时期分泌和形成高效杀虫蛋白,包括营养期分泌的杀虫蛋白(Vips),以及在对数生长期即芽胞形成的同时,形成由cry基因编码的杀虫晶体蛋白(ICPs),使其成为了一种杀虫效果好、安全的杀虫微生物,并且已在微生物杀虫剂、转基因等方面得到了广泛的应用。
为能获得对小地老虎(Agrotisypsilon)有高致死活性的苏云金芽胞杆菌,并为微生物杀虫剂提供良好的材料,本研究以标准菌株库斯塔克亚种(B.thuringiensis subsp.kurstaki)HD-1为对照菌株,以及4株对小地老虎有高生测致死活性的候选菌株PS9-D12、PS9-C12、PS9-D11、PS9-H9共5株Bt菌,分别对比分析了菌株生长情况、基因类型、蛋白表达类型、以及生物活性。
通过对菌株的生长情况的对比,菌株生长曲线显示,菌株PS9-H9与HD-1有较高且相似的生长速度和生物产量,而PS9-D12的最低；分别通过PCR-RFLP和基因测序比对对菌株含有的基因类型进行分析,结果PS9-D12、PS9-C12含有的基因类型丰富,包括crylA／crylI,cry2A、vip2A和vip3A,同时获得3个新基因:crylAa17、crylAa18、cry2Ab17；菌株蛋白经MALDI-TOF-MS分析,PS9-D12、PS9-C12均检测到杀虫蛋白CrylAa、CrylAc、Cry2Ab,菌株PS9-H9仅检测到CrylAc的表达,并发现PS9-D12、PS9-C12中可能含有其他新基因。
分别制备不同生测样品测定对小地老虎的毒力,使用菌株HD—1、PS9-D12、PS9-C12、PS9-D11、PS9-H9的胞晶混合冻干粉(mg.g-1)LC50为:0.71、0.19、0.14、0.24、1.16,芽胞冻干粉(mg.g-1)LC50为:4.21、2.55、2.99、4.03、6.55,生测数据经SPSS软件分析,菌株PS9-D12、PS9-C12的胞晶混合冻干粉与其他菌株生测样品的生测结果差异极显著(P<0.05),说明菌株PS9-D12、PS9-C12相对于HD-1有很好的生测活性:另外对初孵甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)、2龄小菜蛾(Plutella xylostella)进行生测,结果菌株PS9-D12、PS9-C12同样具有很好的杀虫活性,但是对2龄大猿叶甲(Colaphellusbowringi)无活性。
最终本实验克隆了3个cry新基因的全长基因,并已注册登记,完成了异源表达:且获得2株基因类型丰富、且对初孵小地老虎的杀虫活性比已商业化应用的HD-1的活性高的Bt菌PS9-D12、PS9-C12；同时实验也证明了Bt菌株的基因类型、蛋白表达以及芽胞对其生物活性有很大的影响,为微生物杀虫剂材料的选用提供参考依据。