尿嘧啶是生物体中参与RNA合成的重要活性物质,编码生物所需的蛋白质序列信息,也是精细化工、农药和医药的重要中间体,具有广泛的应用。当今合成尿嘧啶的方式主要为化学方法合成,在合成过程中会使用到强碱和有机溶剂,产生难以处理的废水,对环境造成一定的危害。为此,本研究通过生物转化的方法将底物尿苷转化为尿嘧啶,减少化学方法对环境的危害。本文以E.coli BL21（DE3）作为嘧啶核糖核苷水解酶（Pyrimidine-specific ribonucleoside hydrolase RihA,RihA）表达宿主,使用全细胞生物催化方法将底物尿苷转化为尿嘧啶。期望通过优化信号肽和与分子伴侣共表达以及敲除与细胞壁合成有关的羧肽酶基因的方式,提高RihA的可溶性表达,进而提高尿苷的转化速率。主要研究内容及结果如下:1.构建p ET22b-RihA质粒,并在E.coli BL21（DE3）中重组表达,结果显示胞外酶活为0.77 U/m L,胞内酶活为1.48 U/m L,说大部分可溶性酶蛋白存在于胞内。SDS-PAGE蛋白电泳表明有大量的包涵体产生。2.优化信号肽。选择Fhud、Omp A、Omp C、Omp F、Omp T、Pho A、Pho E七种信号肽,替换原始p ET22b-RihA中的Pel B信号肽,通过投底物发酵测定尿苷的转化情况。在发酵液中的初始尿苷含量约为55 g/L时,信号肽为Pel B的原始菌株A和信号肽为Pho A的菌株B在投底物10 h时尿苷底物几乎全部被转化,而剩余的菌株发酵液均含有残留的尿苷,因此,选择含这两种信号肽的菌株进行下一步研究。3.以p CDM4为骨架构建分子伴侣质粒,将优化后的信号肽质粒与分子伴侣质粒在E.coli BL21中共表达。投底物发酵结果表明,对尿苷转化效果最好的菌株为来源于碱性磷酸酶的Pho A信号肽和分子伴侣Gro ES-Gro EL共表达的菌株F,在发酵液中初始尿苷含量约为65 g/L时,投底物15 h时尿苷的转化率为98.9%,而原始菌株A的尿苷转化率为80.2%;酶活测定结果表明,胞外RihA酶活最高的为Pel B信号肽和分子伴侣Gro ES-Gro EL共表达的菌株C,其RihA酶活力为7.70 U/m L,是原始菌株A的10.0倍。总可溶性RihA酶活最高的为Pho A信号肽和分子伴侣Dna K-Dna J-Grp E共表达的菌株G,其RihA酶活力为9.99 U/m L,是原始菌株A的4.45倍。SDS-PAGE电泳条带显示,菌株C、D、E、F、H中的破碎沉淀（包涵体）目的条带明显比原始菌株A中的条带小,而发酵上清均有明显的目的条带。说明分子伴侣蛋白能提高RihA酶的可溶性表达,减少无活性包涵体的产生。4.使用Red重组技术分别敲除E.coli BL21（DE3）中dac A、dac B、dac C,获得三株单敲除菌株和一株dac B/dac C双敲除菌株,将步骤3中对尿苷转化最优的质粒组合转化入这些菌株中,投底物发酵结果表明这些敲除菌株与菌株F相比,它们对尿苷的转化速率没有明显变化,因此继续选择菌株F进行下一步研究。5.研究不同底物浓度对尿苷转化的影响。通过投入不同浓度的尿苷底物,结合经济角度考虑,在投入与发酵液一倍体积的底物为最佳投料浓度:底物转化时间约53 h,尿嘧啶产量为73.45 g/L,尿嘧啶产率为98.16%。本研究以大肠杆菌为宿主,使用全细胞生物催化的方法将尿苷转化为尿嘧啶,其生产工艺步骤较为简单,对环境绿色友好,为生物转化法制备尿嘧啶奠定了基础。