桑枯萎病中菠萝泛菌的分离鉴定及防治研究

来源 :华南农业大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:tj_tong
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桑细菌性枯萎病,又称桑枯萎病,是由多个属的病原引起的毁灭性、土传性病害。目前对其病原种类还未完全确定,因此,分离鉴定其主要病原并建立快速的分子检测方法显得尤为重要。另外,还需要寻找有拮抗作用的生防菌来达到安全、长效的生物防治目的。本研究对收集华南多个蚕区桑园的桑枯萎病病样,通过稀释涂布平板法、平板划线法、形态特征鉴别、生理生化鉴别,分子生物学鉴别对病原菌进行纯化及鉴定;通过高通量测序及生物信息学分析对病原菌进行全基因测序、组装及注释并比对获得特异区段设计引物,建立病原菌的快速分子检测方法;通过室内平板抑菌、盆栽防治以及家蚕安全性试验,探究氯溴异氰尿酸(Chlorobromoisocyanurate)和水杨酸(salicylic acid,SA)两种化学药剂的防效及安全性;采用室内平板抑菌试验筛选对病原菌有较好拮抗作用的生防菌,并通过形态特征鉴别、生理生化鉴别,分子生物学鉴别对其进行鉴定,通过高通量测序及生物信息学分析对其基因组测序、组装及注释,主要研究结果如下:(1)在广西柳州、象州、忻城、柳城、广东英德、顺德等地的桑枯萎病病样分离到青枯劳尔氏菌(Ralstonia solanacearum)、阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)新的致病菌菠萝泛菌(Pantoea ananatis LC001);菠萝泛菌(P.Ananatis LC001)基因组:全长4,499,350bpg,预测得到t RNA 81个,r RNA 22个,CDS 3418个,GC含量55.15%,该菌株保藏于广东省微生物菌种保藏中心,GDMCC No:1.1601。(2)菠萝泛菌特异区段处1061295bp-1062175bp,设计引物FJ-F1/FJ-R1,建立了菠萝泛菌(P.ananatis)的分子检测方法,该方法特异性好,灵敏度高,病原菌菠萝泛菌(P.ananatis)基因组检出限为2.5×10-6ng/μL,菌液检出限为1×10~2cfu/m L(专利申请号:201910441478.0)。(3)氯溴异氰尿酸和水杨酸对三种桑树枯萎病病原菌菠萝泛菌、青枯劳尔氏菌和阴沟肠杆菌的防治结果表明,氯溴异氰尿酸对三种病原的平板抑菌浓度范围分别为500 mg/L-5 g/L、500 mg/L-5 g/L和250 mg/L-5 g/L,1000 mg/L氯溴异氰尿酸对不同致病菌导致的桑枯萎病病情指数均有下降,使阴沟肠杆菌(E.cloacae)导致的枯萎病病情指数下降了50.14,防效为71.14%,使菠萝泛菌(P.ananatis)导致的枯萎病病情指数下降了59.65,防效为74.34%。小于1000mg/L的氯溴异氰尿酸对家蚕的生长发育过程和茧质的影响不明显(P>0.05)。水杨酸对三种病原的抑菌浓度范围分别为500 mg/L-2000 mg/L、500 mg/L-2000 mg/L和250 mg/L-2000 mg/L;1000mg/L水杨酸对不同致病菌导致的桑枯萎病病情指数均有下降,使阴沟肠杆菌(E.cloacae)导致的枯萎病病情指数下降了55.11,防效为73.25%,使菠萝泛菌(P.ananatis)导致的枯萎病病情指数下降了55.42,防效为78.54%;小1000mg/L的水杨酸对家蚕的生长发育过程和茧质的影响不明显(P>0.05)。(4)从桑树根部分离到一株对桑枯萎病和烟草病原有良好拮抗效果的铜绿假单胞菌(P.aeruginosa YD-001,专利申请号:201910282354.2),该菌株保藏于广东省微生物菌种保藏中心,GDMCC No:60613。该拮抗菌对桑枯萎病病原菠萝泛菌(P.aeruginosa)、阴沟肠杆菌(E.cloacae)和桑青枯病病原青枯劳尔氏菌(R.solanacearum)均有良好的拮抗效果,抑菌圈直径分别为15.5±0.23mm、25.2±0.12mm、30.8±0.14mm,同时对烟草土传病害根腐病病原尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)黑胫病病原寄生疫霉菌(Phytophthora parasitica)的抑菌率分别达到83%和75%。全基因组测序结果表明,全长6,496,756 bp、GC含量66.27%、编码蛋白基因5560个、r RNA 8个、t RNA 64个。综上,本研究由桑枯萎病样本中分离到了新的致病菌菠萝泛菌(P.ananatis)并完成了菠萝泛菌菌株(Pantoea ananatis LC001)全基因组测序、组装及注释和快速PCR分子检测方法的建立,为桑枯萎病的研究和防治奠定了基础;另外,对氯溴异氰尿酸和水杨酸防治方法的研究,拮抗菌(P.aeruginosa YD-001)的分离和鉴定,均为桑枯萎病的防治提供了理论和应用参考。
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