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目的ABCG2是ABC转运蛋白家族的成员,具有将其底物泵出细胞外的功能。高度保守的C motif是被认为是识别ABC转运蛋白的标志序列,但是在ABCG2中的作用尚不清楚。我们发现在ABCG2的C motif序列中存在多个翻译后修饰位点和多态性位点(Single Nucleotide Polymorphism,SNP)。本论文拟研究C motif对ABCG2的调控作用。方法1)通过定点突变构建ABCG2突变体,用RT-PCR和Western blot检测在m RNA水平和蛋白水平的表达。2)通过蛋白去糖基化、蛋白转运阻滞、蛋白定位和氨基酸的电荷分析研究C motif对ABCG2蛋白转运的调控。3)通过半衰期测定、蛋白的降解途径检测以及二聚体的形成分析C motif对ABCG2蛋白稳定性的影响。4)通过ATP结合实验、ATPase活性检测、TMD截短以及底物外排作用分析C motif对ABCG2 ATPase活性的影响。结果1)成功构建并表达了ABCG2突变体T194A、T194D、S195A、S195D、AA、DD、R191S、K192E、T194I、KKK、AAA和EEE(其中AA是将T194和S195同时突变成A的双点突变,DD为将T194和S195同时突变成D的双点突变,KKK、AAA和EEE是分别将C motif的RKR三个氨基酸同时突变后的结果)。2)与野生型(WT)相比,在m RNA表达水平,所有的突变体均没有差异;在蛋白表达水平,C motif正电荷没有变化的突变体T194A、S195A、AA、T194I和KKK也没有差异,但是C motif正电荷丢失的突变体T194D、S195D、DD、R191S、K192E、AAA和EEE表达水平很低。3)ABCG2 C motif正电荷丢失的突变体没有在高尔基体进行成熟的糖基化修饰,而是滞留在内质网,诱发了内质网应激效应,启动内质网介导的降解路径(endoplasmic reticulum associated degradation,ERAD)经由蛋白酶体降解。与在溶酶体中降解的WT相比,半衰期缩短到4h以内。4)功能分析结果显示C motif正电荷丢失的突变体依然能够结合ATP,但是丢失了ATPase活性,进一步引起药物外排功能的缺失。结论C motif正电荷的缺失引起ABCG2蛋白转运异常、稳定性降低、ATPase活性丧失以及药物外排功能缺失。