柱花草(Stylosanthes spp.)原产于美洲的热带和亚热带地区,最适宜的生长纬度在北纬30°至南纬30°之间,是一类在全球热带地区栽培种植面积最大且应用最为广泛的优良热带豆科牧草,可用于动物的青饲料、干草粉生产、水土保持和放牧等。柱花草的生长习性为喜温多湿,可在干旱和低肥力地区生长,耐贫瘠,耐低磷,耐热,耐酸性廋土,抗虫害,但不耐低温,低温是限制柱花草向高纬度推广的重要限制因子。本研究在柱花草的育种改良过程中,从细茎柱花草(S.guianensis var.intermedia)中获得一个较为抗寒的新品系“89-1”,利用新一代Illumina测序技术对该柱花草抗寒新品系在低温(4℃)和适温(28℃)环境下的转录组进行测序,在转录组测序的基础上,对柱花草SgNAC1、SgNAC2和SgGH3基因进行克隆及功能分析,主要研究结果如下:(1)对细茎柱花草抗寒新品系89-1和圭亚那柱花草TPRC2001-1同时进行低温(4℃)处理0h、24h和48h,测定不同低温处理时期叶片的各项生理指标,结果表明,低温处理0h时,二者的各项生理指标差异不大,但低温处理48h后,TPRC2001-1的相对电导率和丙二醛含量分别是89-1的2.10与1.57倍,而89-1的脯氨酸、可溶性糖和可溶性蛋白等可溶性渗透调节物质的含量分别达到TPRC2001-1的1.45、1.24和1.28倍。说明89-1对低温的抵御能力强于TPRC2001-1,对低温具有一定的抗性。(2)对转录组测序获得的序列进行过滤、拼接、组装和注释,从对照组(CK)和低温处理组(LT)中分别获得89,868,386和91,942,130条高质量reads,可拼接出222,717条长度在201~12,267nt之间的contig,这些contig进一步组装成83,873个unigenes。注释结果表明,有10,7349、63,990和53,797个contig可分别注释到NR、Swiss-Prot和KEGG数据库,序列相似匹配度最高的物种为大豆(Glycine max)。GO分类可将42.90%的contig归入到3个功能类别的54个功能组,COG功能分类将25.57%的contig分为24个功能体系,此外,KEGG将21.50%的contig归入到238条pathway。低温胁迫和适温条件下,显著差异表达的unigenes数有42,588个,其中41.18%的unigenes为上调表达。差异表达基因显著富集的pathway有18条,其中最为显著富集的pathway是角质、软木脂和蜡质生物合成途径,这些物质的合成与不饱和脂肪酸合成有关。从差异表达基因中共鉴定出9类转录因子,其中的多数参与了信号转导途径。(3)根据转录组测序获得sgnac1、sgnac2的部分cds序列和sggh3基因的cds全长序列,利用hitail-pcr技术,克隆了sgnac1和sgnac2基因的cds全长序列。sgnac1、sgnac2和sggh3的cds全长分别为909、777和1,809bp,sgnac1和sgnac2都由3个外显子和2个内含子组成,基因组dna全长分别为1,185和951bp。在sgnac1和sgnac2的蛋白结构中都含有一段保守的nam结构域,推测它们都是nac类转录因子,并通过酵母单杂交技术对其转录激活活性进行了验证。sggh3具有植物gh3蛋白特征,多序列比对和进化分析表明其属于与生长素合成相关的gh3家族成员。基因表达分析表明,sgnac1和sgnac2都在早期响应低温,而sggh3则可能属于在后期对低温进行响应的基因。(4)在原生质体的分离过程中,以柱花草的幼嫩叶片为分离材料,通过对各种影响因素的筛选,分离得到高质量柱花草原生质体的最佳酶液组合为:1.5%纤维素酶+0.4%离析酶,最适酶解时间为8h,最佳甘露醇浓度和mes浓度分别是0.4mol/l和20mmol/l。完善后的分离体系,可得到数量在3.0×106个/gfw左右、活力高于80%的原生质体。通过peg介导转化法,使融合gfp的sgnac1和sgnac2基因在35s的驱动下分别在柱花草原生质体中瞬时表达,将sgnac1和sgnac2蛋白定位于细胞核中。(5)构建了sgnac1、sgnac2和sggh3基因的过表达载体,并通过农杆菌转化技术分别转化野生型烟草,成功的获得转基因植株。通过荧光定量pcr对sgnac1、sgnac2和sggh3在转基因烟草中的表达模式进行分析,发现sgnac1、sgnac2的表达量在低温处理6h后,分别上升了2.89和2.68倍。sggh3在低温处理前期的表达量较低,24h时达到最高,为处理起始时期的6.46倍,在之后的24h内只下降了8.30%。基因表达分析表明,低温胁迫下,sgnac1和sgnac2作为转录因子较早地响应低温,而sggh3可能受其他基因的调控,在后期表达。对转基因烟草各项生理指标的测定结果表明,低温处理48h后,野生型的相对电导率和丙二醛含量分别是转基因植株sgnac1-oe、sgnac2-oe和sggh3-oe的1.32、1.24和1.48倍,脯氨酸、可溶性糖与可溶性蛋白等物质分别只达到转基因植株的71.95%、74.40%和63.11%,说明sgnac1、sgnac2和sggh3基因的过表达在一定程度上降低了细胞膜在低温下的受损程度,促进了胞内渗透调节物质的积累,提高了烟草的抗寒性。