研究背景:在世界范围内,金黄色葡萄球菌是引起重症肺炎和菌血症等医院内侵袭性感染的重要病原体,同时也是社区获得性感染的主要病原体之一。随着临床治疗中抗生素越来越频繁的使用,出现了大量具有多重耐药性的“超级病菌”,即耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌（Methicillin-resistant Staphylococcus aureus,MRSA）。MRSA在临床患者中的大量出现直接导致其治疗更为困难。近年来的研究发现,携带杀伤白细胞素（pvl）基因的MRSA菌毒力更强危害更广,可以造成严重的社区内感染,并严重危及感染者生命,由其引起的坏死性肺炎的死亡率可达75%。目前临床对于携带pvl基因的MRSA菌尚无快速鉴定方法,非常不利于感染者的及时诊断和治疗,因此建立相关快速检测技术极具临床价值。目前对于携带pvl基因的MRSA菌的致病机制仍不明晰,通过其致病机制的研究可以为临床治疗提供新的思路。研究目的:1.建立携带pvl基因的MRSA菌的快速检测技术;2.研究携带pvl基因的MRSA菌诱导巨噬细胞（THP-1细胞）自噬、凋亡和焦亡机制;3.研究携带pvl基因的MRSA菌诱导上皮细胞（A549细胞）的自噬、凋亡和坏死机制。研究方法:1.建立改良碱裂解法提取金黄色葡萄球菌基因组DNA,采用PCR方法检测spa、mecA、femB、pvl基因,并使用LAMP技术检测spa、mecA基因,建立MRSA菌快速检测技术。2.通过大肠杆菌内原核表达技术制备重组杀白细胞素rPVL-S蛋白,免疫新西兰兔制备抗血清,以此抗血清采用Western blotting法检测金黄色葡萄球菌PVL蛋白表达,建立金黄色葡萄球菌PVL蛋白的快速检测技术。3.采用PCR法和Western blotting法检测金黄色葡萄球菌spa、mecA、pvl基因表达,筛选出1株表达PVL的MRSA菌株(MRSA^PVL+菌株)和一株不表达PVL的MRSA菌株(MRSA^PVL-菌株)用于后续实验研究。4.分别以MRSA^PVL+菌株和MRSA^PVL-菌株与THP-1细胞共培养1 h、3 h、6 h,中止实验后提取细胞总RNA通过RT-PCR法检测自噬相关基因（atg3、atg4B、atg5、atg7、atg12和atg16L1）,各种细胞因子（IL-4、IL-1β、IL-6、IL-10、IL-12、IFN-α和TGF-β）、炎症复合体（NLRP3、Caspase-1和IL-1β）和Toll样受体（TLR-2和TLR-4）的表达量差异;提取细胞总蛋白通过Western blotting法检测自噬相关蛋白Beclin-1和LC-3的表达,PI3K、Akt和mTOR的磷酸化水平,凋亡相关蛋白Caspase-3活化程度,焦亡相关蛋白GSDMD、NLRP3和Caspase-1的表达。5.通过转染NLRP3-siRNA抑制THP-1细胞NLRP3表达,分别以MRSA^PVL+菌株和MRSA^PVL-菌株与THP-1细胞共培养1 h、3 h、6 h,提取各时间点细胞总蛋白,通过Western blotting法检测自噬相关蛋白Beclin-1和LC-3B表达量,凋亡相关蛋白Caspase-3活化程度,核因子NF-κB p65蛋白,焦亡相关蛋白GSDMD、NLRP3和Caspase-1表达量。6.MRSA^PVL+菌株和MRSA^PVL-菌株分别与THP-1细胞共培养1 h、3 h、6 h,采用DCFH-DA荧光探针法检测各时间点细胞内活性氧（ROS）表达量,采用Annexin V-FITC/PI法检测细胞凋亡率。7.分别使用MRSA^PVL+菌株和MRSA^PVL-菌株与A549细胞共培养1 h、3 h、6 h,提取细胞蛋白通过Western blotting法检测自噬相关蛋白Beclin-1和LC-3B表达量,凋亡相关蛋白Caspase-3活化程度。8.MRSA^PVL+菌株和MRSA^PVL-菌株与A549细胞共培养1 h、3 h、6 h,采用DCFH-DA荧光探针法检测细胞活性氧（ROS）表达量;Annexin V-FITC/PI法检测细胞凋亡率。研究结果:1.分别建立基于PCR法和LAMP法检测金黄色葡萄球菌spa基因和mecA基因的MRSA菌快速检测技术。2.分别建立基于PCR法和Western blotting法的金黄色葡萄球菌PVL快速检测技术。3.经PCR法和Western blotting法筛选鉴定出1株不表达PVL的MRSA菌(MRSA^PVL-株)和1株表达PVL的MRSA菌(MRSA^PVL+株),用于后续研究。4.MRSA^PVL-株和MRSA^PVL+株均可以诱导THP-1细胞和A549细胞内产生大量活性氧（ROS）,并且随着感染时间的延长,THP-1细胞和A549细胞内ROS积累持续增多,6 h时ROS表达量最高。MRSA^PVL+株诱导THP-1细胞和A549细胞产生ROS量显著高于MRSA^PVL-株（P<0.05）。5.MRSA^PVL-株和MRSA^PVL+株均可在1 h时诱导THP-1细胞发生自噬,3 h时自噬最为显著,且MRSA^PVL+株诱导THP-1细胞自噬能力显著强于MRSA^PVL-株（P<0.05）;MRSA^PVL-株和MRSA^PVL+株均可以通过抑制THP-1细胞PI3K、Akt和mTOR蛋白的磷酸化来诱导自噬,在1 h、3 h、6 h时均有变化,1 h和3 h更为明显,并且MRSA^PVL+株抑制上述蛋白磷酸化能力强于MRSA^PVL-株（P<0.05）。6.MRSA^PVL-株和MRSA^PVL+株均可以诱导THP-1细胞和A549细胞发生具有时间依赖性的凋亡现象,6 h时细胞凋亡率最高,且MRSA^PVL+株诱导两种细胞凋亡能力较MRSA^PVL-株更为显著（P<0.05）。两种MRSA菌株诱导THP-1细胞以早期凋亡为主,A549细胞以晚期凋亡为主。7.MRSA^PVL-株和MRSA^PVL+株可以诱导THP-1细胞释放大量炎性因子以及炎症复合物相关因子,感染1 h时,MRSA^PVL+株刺激细胞使IL-1β、IL-6、IL-12、IL-17A和IFN-α基因表达量有显著升高（P<0.01）;感染3 h时,MRSA^PVL+组IL-4、IL-1β和TGF-β基因表达量有升高（P<0.05）,但是幅度较1 h明显降低;感染6 h时,MRSA^PVL-组细胞IL-4和IFN-α基因表达量显著升高（P<0.05）,MRSA^PVL+组细胞因子IL-4、IL-1β、IL-10、TGF-β、IL-6、IL-17A和IFN-α的表达量升高（P<0.01）。MRSA^PVL-株和MRSA^PVL+株作用下炎症复合物相关因子NLRP3在1 h有升高,6 h处仅MRSA^PVL+株刺激下细胞表达增多,MRSA^PVL-株和MRSA^PVL+株诱导下的THP-1细胞Caspase-1和IL-1β在1 h、3 h和6 h随时间延长表达量逐渐增加。所有炎症相关因子在MRSA^PVL+株刺激作用下较MRSA^PVL-株作用更为显著,两者刺激后的THP-1细胞中炎症相关因子表达有明显差异（P<0.05）。MRSA^PVL-株和MRSA^PVL+株可以促使THP-1细胞活化NF-κB蛋白磷酸化,并且在1 h时即可见明显升高,MRSA^PVL+株的作用更强。MRSA^PVL-株和MRSA^PVL+株可以刺激THP-1细胞产生炎症复合物相关蛋白表达升高,NLRP3蛋白1 h升高最明显,6 h时次之,3 h时不明显,细胞Caspase-1蛋白表达量在MRSA^PVL-株作用下于1 h和3 h时有显著升高,在MRSA^PVL+株作用下1h、3 h和6 h时均显著升高,MRSA^PVL+株诱导THP-1细胞Caspase-1蛋白能力强于同样MRSA^PVL-株。8.MRSA^PVL-株和MRSA^PVL+株可以诱导THP-1细胞的焦亡相关蛋白GSDMD表达变化,但仅3 h时较对照组有显著变化（P<0.05）。9.抑制THP-1细胞的NLRP3表达后,MRSA^PVL-株和MRSA^PVL+株感染1 h、3h和6 h时,siRNA组细胞NLRP3和Caspase-1表达量显著低于对照组细胞（P<0.05）,自噬相关蛋白LC3和Beclin-1在1 h和3 h时表达量显著低于对照组细胞（P<0.05）,凋亡相关蛋白Caspase-3在1 h、3 h和6 h时表达量均显著低于对照组（P<0.05）,焦亡相关蛋白GSDMD在3 h时表达量显著低于对照组（P<0.05）。研究结论:MRSA菌可以诱导THP-1细胞的自噬和凋亡,并诱导A549细胞凋亡。携带pvl基因的MRSA菌诱导上述细胞自噬和凋亡能力显著增加。携带pvl基因的MRSA菌可以在Toll样受体的介导下通过抑制PI3K/Akt-mTOR信号通路以增加THP-1细胞自噬和凋亡水平,其过程伴随着细胞内ROS的大量表达,以及炎症复合体的活化和大量促炎细胞因子表达,最终导致THP-1细胞和A549细胞自噬、凋亡以及坏死的发生。MRSA菌也可以诱导THP-1细胞焦亡的发生,并且携带pvl基因的MRSA菌诱导细胞焦亡能力更强。抑制THP-1细胞炎症复合体NLRP3表达可以抑制细胞焦亡发生,并减少各种促炎细胞因子表达,减轻患者炎症反应。