背景乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染呈世界性流行，急慢性肝炎中的特征性病理改变，如肝小叶内的点状坏死和汇管区边缘的嗜酸性坏死的实质均为凋亡，表明肝细胞凋亡是病毒性肝炎的重要病理现象，与肝组织炎症的发生有密切联系。一贯认为凋亡是细胞主动的死亡过程，不引起炎症反应，但这与临床现象并不符合。可能只有在凋亡细胞迅速被吞噬而无毒性物质漏出时，才不引发炎症反应。如凋亡细胞数过多或吞噬细胞识别、吞噬能力存在障碍，细胞内容物释放，将导致炎症反应及组织损伤，这可能是某些疾病的重要发病机制。病毒感染与宿主细胞凋亡之间可能有多方面的关系，HBV蛋白可能是调控肝细胞凋亡的一个必要因子。因HBV的X蛋白有多种活性，能调控细胞内的多种信号转导路径，故一些学者首先研究其对肝细胞凋亡的作用。但不同学者的研究结果不同：X蛋白与P53结合抑制凋亡、而促使细胞的恶性转化；最近的研究还表明X蛋白抑制Caspase 3的活性、或通过上调SAPK／JNK信号抑制Fas介导的凋亡；但与肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-alpha，TNFα)结合则提高凋亡的敏感性，或通过其反式激活强化凋亡。提示同一病毒蛋白在肝细胞的不同情况可起完全相反的作用，也促使我们思索HBV是否还有某一成份能较稳定抑制肝细胞凋亡。HBV有2个核壳的开放读框，其一指导合成21kDa的P21蛋白(hepatitis Bvirus c agent, HBcAg)，是病毒核壳的结构成份；另一产生25kDa的前C／C蛋白，(终产物hepatitis B virus e agent, HBeAg)是免疫的调节因子，与乙型肝炎的发病机制关系最为密切。其在内质网膜上截去信号肽后成为P22~e。P22~e的大部分进入内质网，水解除去羧基端的肽段形成17kDa的HBeAg后才能向细胞外分泌。小部分P22~e仍滞留于肝细胞浆内，长期以来对滞留的P22~e在感染中的作用不明。在对HBV前C／nt 1896终止密码子变异的研究中，发现细胞内的P22~e能与HBcAg形成杂合的核壳结构而抑制病毒颗粒的包装过程，故前C／C蛋白的缺失可导致病毒高复制。但我国的慢性HBV感染在血清HBe转换时出现的前C变异，常伴随病毒复制序列水平降低，这与其具有高复制能力似相矛盾。对此可能的解释是前C变异株诱导感染肝细胞凋亡促使病毒清除，与HBeAg抑制免疫而增强病毒复制符合，从而提出：P22~e蛋白是否有抑制肝细胞凋亡的作用?本实验室刘定燮博士在博士研究中，曾经阐明了表达P22~e蛋白的HepG2细胞有抑制甲氨喋呤，环孢素A等诱导凋亡的作用，但是对于抑制凋亡的分子途径仍未进一研究。我们发现P22~e的后一段序列(AA23-73)与Fas(接收凋亡信号的细胞表面分子)死亡区结合蛋白(FADD)的死亡效应区(DED)有23.5％的同源性。肝细胞通过FADD对TNFα敏感而诱导凋亡，已知有与DED氨基酸同源序列的Ⅱ型单纯疱疹病毒E8蛋白和传染性软疣病毒MC159蛋白，能抑制Fas抗体(一种促效抗体，agonist antibody)和TNF诱导的细胞凋亡，HBV的P22~e蛋白可能也有相同的作用，但迄今尚无研究报告。滞留的P22~e通过TNF-TNFL、Fas-FasL中哪一条途径抑制细胞凋亡，目前仍未见相关研究论文发表。Tai等发现丙肝病毒(hepatitis C virus, HCV)感染的肝脏和HCV核心转染的细胞中都有核转录因子κB(nuclear factorκB, NF-κB)的激活，HCV感染的肝脏较正常者更易见到NF-κB的核染色，HCV核心转染的细胞中NF-κB激活产生对TNF诱导凋亡的抵抗，用四氢吡咯二硫代氨基甲酸盐(PDTC)抑制NF-κB活化能使敏感性恢复，这些结果提示HCV感染可能通过激活NF-κB抑制凋亡，且HCV能逃避宿主的免疫监视使得病毒持续存在，从而可能形成肝癌。也有报道HBV的X蛋白可激活NF-κB或经NF-κB抑止HepG2凋亡。一贯认为NF-κB在肝胚胎瘤发展以及肝细胞再生时，是一个基本的、必需的“生存因子”；而且NF-κB还被证实是细胞在各种外界刺激作用下起主要调节作用。一些病毒诱导的宿主细胞凋亡反应与NF-κB激活有关，病毒感染后激活的NF-κB可能是激活天然免疫从而产生抗病毒活性的快速途径。NF-κB在肝脏病变中的作用究竟是通过TNF-TNFL还是Fas-FasL途径，目前仍未见相关研究。NF-κB在成熟B细胞和浆细胞中发现的这种蛋白能与免疫球蛋白κ轻链内含增强子的特异性序列结合，该序列由10个核苷酸组成(5-GGGACTTTCC-3)，命名为NF-κB。NF-κB广泛存在于真核生物中，是一个由复杂的多肽亚单位组成的蛋白家族。它作为信号传导途径中的枢纽与机体免疫，肿瘤的发生、发展，细胞凋亡的调节以及胚胎发育等重要事件有着密切联系，是一种重要的核转录因子。目前，对NF-κB的研究已成为一个非常引人关注的领域。关于细胞凋亡，目前国内外均侧重于对凋亡信号在细胞内转导过程的研究。通过激活或是抑制细胞内某一蛋白的表达，研究其在细胞凋亡某一途径中的作用，丰富和完善细胞凋亡的通路，更清楚地阐明肝病的发病机制。从分子水平阐明凋亡发生的机理，将是凋亡研究的方向以及热点。此项课题将研究在以TNFα为刺激信号的细胞凋亡过程中，HBVP22~e，NF-κB在此过程中的相互作用，进一步阐明HBV感染与免疫的某些基本问题。为此，本课题得到了国家自然科学基金支持。目的克隆乙型肝炎病毒P22~e基因，构建其真核表达载体pEGFP-C2HBVP22~e，以人肝细胞癌HepG2细胞系为研究模型，探讨在肝细胞凋亡过程中，HBVP22~e基因是否通过NF-κB的信号途径来抑制肝细胞凋亡的发生。方法1．以含1.2 copies HBV基因(adr亚型)p3.8Ⅱ质粒为模板，以PrimerCl：1873-1891 5’GGA ATTCATGTCCAAGCTGTGCCTTGGGT3’(插入EcoR I酶切位点)，PrimerC2：2454-2434 5’GCGGATCCCTAACATTGAGATTCCCGA 3’(插入BamH I酶切位点)为一对引物按常规方法进行PCR，获得HBVP22~e基因cDNA。2．利用通用T载体pMD18-T，将PCR获得的HBVP22~e基因cDNA进行克隆，获得克隆载体pMD18-THBVP22~e，进行EcoR I，BamH I双酶切鉴定及克隆测序，以保证获得HBVP22~e基因序列准确无误。3．将pMD18-THBVP22~e EcoR I，BamH I双酶切获得HBVP22~e cDNA回收纯化，利用pEGFP-C2质粒，构建HBVP22~e真核表达载体pEGFP-C2HBVP22~e。进行EcoR I，BamH I双酶切鉴定及测序，以保证以后表达HBVP22~e基因序列准确无误。4．脂质体转染pEGFP-C2HBVP22~e真核表达载体到HepG2细胞株中，经G418及有限稀释法筛选，获得含HBVP22~e基因的人肝细胞癌HepG2细胞株，并用免疫组化鉴定EGFP-HBVP22~e融合蛋白细胞内的表达；微粒子免疫检测培养上清中分泌的EGFP-HBVP22~e融合蛋白；荧光显微镜观察和Western Blot检测验证所获得的稳定转染细胞系能够稳定表达EGFP-HBVP22~e融合蛋白；Western Blot及细胞免疫组化使用抗HBe抗体验证融合了EGFP的HBP22~e蛋白的免疫原性。5．已终浓度333nM Act-D及100μg／L TNFα诱导刺激HepG2EGFP-HBVP22~e细胞凋亡，同时以HepG2细胞作为实验对照，刺激时间8h、16h、24h、32h、40h、48h，使用流式细胞术(Flow Cytometry, FCM)，利用碘化丙啶(Propidium iodide, PI)染色，检测具有亚G1划DNA含量的细胞比例，代表凋亡细胞数；使用激光共聚焦显微镜(Laser Scanning Confocal Microscopy)，观察Hoechst染色凋亡细胞核形态的变化。6．由TNFα诱导的HepG2EGFP-C2HBVP22~e细胞系的凋亡过程中，采用激光共聚交显微镜、经典的核蛋白电泳迁移率(electrophoretic mobility shift assay, EMSA)技术及采用NF-κB抑制剂Calpain InhibitorⅠ(ALLN)抑制其信号通路，检测观察NF-κB的核转移、活化等，以期探寻在HBVP22~e抑制肝细胞凋亡过程中，NF-κB信号途径的重要意义。结果1．经EcoR I，BamH I双酶切鉴定及克隆测序，证明获得HBVP22~e基因序列准确无误，获得HBVP22~e基因克隆载体pMD18-THBVP22~e。2．经EcoR I，BamH I双酶切鉴定及克隆测序，证明获得含HBVP22~e及增强型绿色荧光蛋白基因真核表达载体pEGFP-C2HBVP22~e。3．利用脂质体法转染HepG2细胞，用G418选择培养、有限稀释法筛选，荧光显微镜观察和Western Blot检测结果表明，所获得的稳定转染细胞系能够稳定表达EGFPHBVP22e融合蛋白。Western Blot及细胞免疫组化的阳性结果说明使用抗HBe抗体可以结合融合了EGFP的HBP22~e，融合蛋白中HBP22~e的抗原性没有发生改变。荧光显微镜观察和组化结果还可以看到HepG2中EGFPHBVP22~e的表达定位于胞浆与胞核，微粒子免疫荧光检测培养上清证实转染分泌蛋白含有HBeAg抗原性的物质。4．流式细胞术PI染色法检测以Act-D，TNFα诱导HepG2，HeoG2EGFP-C2HBVP22~e细胞系发生凋亡结果显示Oh，8h，16h两细胞系凋亡率凋亡比较，P＞0.05，差别不显著；而在24h，32h，40h，48h时，两细胞系凋亡率比较，P＜0.01，差别显著，HepG2EGFP-C2HBVP22~e细胞系凋亡率低于HepG2细胞系。激光共聚交显微镜观察两细胞系24h凋亡率比较，P＜0.01，差别显著。二者结果基本相符。5．激光共聚焦观察以Act-D，TNFα诱导HepG2，HepG2EGFP-C2HBVP22e细胞系发生凋亡前后NF-κB的核内外表达状况，结果显示HepG2EGFP-C2HBVP22~e诱导凋亡前、后，及诱导凋亡后的HepG2与未诱导凋亡的HepG2的NF-κB p65的核浆比例有显著性差异(χ~2=109.072，v=3，P=0.000，组间差异有显著性意义)；HepG2和HepG2EGFP-C2HBVP22~e凋亡后NF-κB p65的核浆比例有显著性差异(χ~2=44.298，v=1，P=0.000，2组间差异有显著性意义)，说明HepG2EGFP-C2HBVP22e细胞系发生凋亡前后NF-κB有明显的核迁移现象。6．HepG2，HepG2EGFP-C2HBVP22~e细胞系经ALLN处理后，流式细胞术检测以Act-D，TNFα诱导的凋亡率发生的变化，结果显示ALLN处理与否HepG2凋亡率相差不显著(t=0.544，P=0.615，差异没有统计学意义)。而ALLN处理HepG2EGFPC-2HBVP22~e后凋亡率显著高于未经ALLN处理的HepG2EGFPC-2HBVP22~e(t=7.515，P=0.002，差异有显著性意义)。说明ALLN抑制NF-κB，从而解除HBVP22~e对有凋亡的抑制作用。7．以Act-D，TNFα诱导HepG2，HepG2EGFP-C2HBVP22e细胞系发生凋亡后，EMSA分析NF-κB核转移状况显示HepG2凋亡前后NF-κB核迁移无差异(t=0.027，P=0.980，差异没有统计学意义)。而HepG2 EGFP-C2HBVP22~e凋亡前后NF-κB有明显的向核内迁移现象(t=9.431，P=0.001，差异有显著性意义)。结论1．实验结果表明，HepG2EGFP-C2HBVP22~e细胞系在发生凋亡的时间上比HepG2细胞系有明显延迟，及凋亡的发生率也明显低于HepG2细胞系，自此可证明HepG2EGFP-C2HBVP22~e细胞系中，由于外源性基因HBVP22~e的引入及表达，对细胞的凋亡有明显的抑制作用。2．激光共聚焦显微镜及EMSA观察以Act-D，TNFα诱导HepG2，HepG2EGFP-C2HBVP22~e细胞系发生凋亡前后NF-κB的核内外表达状况表明，HepG2EGFP-C2HBVP22~e细胞系发生凋亡前后，有明显的NF-κB向核内迁移现象。3．NF-κB抑制剂ALLN的使用，可以使以Act-D，TNFα诱导HepG2EGFP-C2HBVP22~e细胞系凋亡发生率升高。4．由上述结果可以初步推论出在HBVP22~e抑制肝细胞凋亡过程中，NF-κB信号途径有着重要意义。