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第一部分使用非标记探针-熔解曲线分析技术检测真性红细胞增多症患者外周血中JAK2V617F突变及该检测体系在多种荧光定量平台上的验证目的：利用3’端封闭的非标记探针建立一种基于熔解曲线分析检测真性红细胞增多症患者外周血中JAK2V617F突变的方法,并将该方法进行多实验室仪器平台间的比对验证。方法：在RotorGene Q高分辨率熔解分析平台上构建非标记探针-熔解曲线分析检测体系。使用不对称PCR扩增JAK2V617F突变侧翼区域,并在反应体系中加入与所扩增突变型单链完全匹配的非标记探针及饱和染料。在扩增反应结束后对反应产物进行熔解分析,通过熔解曲线中突变峰的表达情况对样本所含突变进行鉴定。分别以人多发性骨髓瘤细胞株RPMI8226(JAK2野生纯合子)与人红白血病细胞株HEL(JAK2V617F突变纯合子)DNA作为突变阴、阳质控,通过系列稀释实验制备含有0%、1%、3%、5%、10%、25%、50%及100%突变负荷的20ng/ml DNA标准品进行检测,以评估所构建检测体系的灵敏度。使用体系突变检出下限的DNA标准品进行20次批内检测与连续20天批间检测,以突变与野生产物熔解温度的变异系数评估体系的检测批内与批间不精密度。使用等位基因特异性扩增(ARMS), Sanger测序与非标记探针熔解分析系统同时检测40例真性红细胞增多症患者与40例健康志愿者外周血DNA中JAK2V617F突变情况,以评估体系检测正确性。最终将所构建体系移植至不同实验室的LightCycer480及PRISM7500、Mastercycler ep realplex等仪器上并对检测结果进行比对,以评估所构建方法的实用程度。结果：对于Rotor-Gene Q高分辨率熔解分析平台,所构建非标记探针熔解分析JAK2V617F突变检测体系可在57.3±0.7℃及63.6±1.1℃分别形成突变与野生熔解峰。梯度稀释实验证实体系可在20ng/ul模板背景中检测负荷为3%的突变。野生型与突变型产物探针熔解温度的批内不精密度分别为1.72%与1.29%,批间不精密度分别为3.14%与3.55%。非标记探针体系与ARMS检测结果完全一致,T-A克隆证实非标记探针体系可检出Sanger测序结果为假阴性的样本,且与使用LightCycer480及PRISM7500、Mastercycler ep realplex等仪器的检测结果也均完全一致。结论：研究使用非标记探针技术构建了可用于检测骨髓增殖性肿瘤诊断标志物JAK2V617F突变的反应体系。该检测体系可对突变进行快速的闭管检测,并适用于各种带有熔解分析功能的荧光检测仪,对于辅助临床进行骨髓增殖性肿瘤诊断具有一定的应用价值。第二部分茎环探针熔解曲线分析技术在JAK2V617F突变检测中的应用目的：构建带有5’端与突变侧翼序列互补结构的茎环探针以在聚合酶链式反应过程中特异性富集骨髓增殖性肿瘤患者外周血中的JAK2V617F突变,并通过熔解分析对其进行检测。方法：采用Rotor-Gene Q高分辨率熔解分析平台构建茎环探针-熔解曲线扩增检测体系。在传统PCR引物5’端添加能与JAK2V617F突变侧翼野生型序列完全互补的寡核苷酸序列作为茎环探针引物,并在该引物5’末端人为引入与所杂交靶序列存在错配的2个碱基以阻滞探针发生二次延伸。最终利用熔解分析技术对由过量茎环引物进行不对称PCR扩增所得的茎环产物进行熔解分析,完成扩增产物的基因型鉴定。分别以人多发性骨髓瘤细胞株RPMI8226(JAK2野生纯合子)与人红白血病细胞株HEL (JAK2V617F突变纯合子)DNA作为突变阴、阳质控,通过系列稀释实验制备含有0%、0.01%、0.1%、1%、10%及100%突变负荷的20ng/mlDNA标准品进行检测,以评估所构建检测体系的灵敏度。使用体系突变检出下限的DNA标准品进行20次批内检测与连续20天批间检测,以突变型茎环熔解温度的变异系数评估体系的检测批内与批间不精密度。同时检测突变检出下限的DNA标准品及野生型标准品各18例,以评估所构建体系突变检测性能的稳定性。使用茎环探针与非标记探针同时检测40例真性红细胞增多症、20例原发性血小板增多症、20例原发性骨髓纤维化患者与40例健康志愿者外周血DNA中JAK2V617F突变情况,并对两者间结果存在差异的样本分别使用外周血DNA及茎环探针体系扩增产物进行Sanger测序以评估体系检测突变的正确性并验证其富集突变的能力。结果：使用Rotor-Gene Q平台进行实验,所构建茎环探针熔解分析检测JAK2V617F突变的体系可在67.3±0.9℃出现突变型产物熔解峰。梯度稀释实验证实体系可在20ng/ul模板背景中检测负荷为0.1%的突变。突变型茎环产物熔解温度的批内与批间不精密度分别为1.47%与2.51%。经过Sanger测序验证发现相比于非标记探针,茎环探针具有特异性富集扩增突变的能力,非标记探针方法的部分检测结果存在假阴性。结论：所构建使用茎环探针检测JAK2V617F突变的熔解分析体系可在1小时内完成对样本中突变序列的特异性富集扩增,整个扩增-检测流程均为闭管反应,且可在多种具有熔解分析功能的荧光检测仪器上进行移植。其对于骨髓增殖性肿瘤、特别是原发性血小板增多症及原发性骨髓纤维化患者的早期诊断具有一定的实用价值。