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H9N2亚型禽流感病毒(H9N2 AIV)是一种低致病性禽流感病毒,能感染多种鸟类和家禽,甚至也能感染包括人和猪在内的哺乳动物。临床上,由H9N2 AIV感染的鸡表现出严重的呼吸道症状、胃肠道和内脏炎症,如气囊炎和腹膜炎,多为继发大肠杆菌感染引起,然而H9N2 AIV感染后继发大肠杆菌的分子机制尚不清楚。本研究旨在研究肉鸡感染H9N2 AIV后肠道菌群组成、肠道屏障和免疫相关因子的变化等,解释肉鸡感染H9N2 AIV继发大肠杆菌的分子机制,为防控H9N2亚型禽流感提供理论指导。本研究对肉鸡回肠和盲肠内容物进行16S rRNA测序,结果表明肉鸡感染H9N2AIV后肠道菌群出现混乱。盲肠微生物主要以厚壁菌门、拟杆菌门、变形菌门为主,攻毒后最显著的变化是拟杆菌门在试验期出现显著下调(p<0.01);回肠微生物主要以厚壁菌门和变形菌门为主,攻毒后最显著的变化是厚壁门急剧地极显著下调(p<0.01)、变形菌门急剧地极显著上调(p<0.01)。通过进一步的菌属水平分析发现:攻毒后5d和12d变形菌门的埃希氏菌属、梭菌属、韦永氏球菌属均极显著上调(p<0.01),而产乳酸类微生物如肠球菌、乳杆菌属、链球菌属等出现不同程度的下调。本研究分析攻毒后5d和12d回肠绒毛结构、紧密连接蛋白、免疫细胞因子和大肠杆菌变化情况,结果表明:(1)通过病理切片发现攻毒后5d和12d回肠粘膜均出现了炎症病变。攻毒后5d回肠绒毛长度变短、隐窝深度变大,绒毛长度与隐窝深度的比值在攻毒后5d和12d均显著小于空白组(p<0.05),表明回肠上皮细胞绒毛和隐窝遭受不同程度的损伤。攻毒后5d和12d,肠上皮细胞的黏蛋白TFF2、胞浆蛋白ZO-1均极显著降低(p<0.01);黏蛋白MUC2、闭合蛋白Occludin、Claudin-3在攻毒后第12d也都显著降低(p<0.05),表明回肠黏液层结构和紧密连接在攻毒后遭受到一定程度的破坏。(2)攻毒后回肠粘膜Rho/Rock1、TLR-21、TGF-β1检测结果表明:Rho表达量在攻毒后5d、12d无显著变化;Rock1表达量在攻毒后5d显著减少(p<0.05),攻毒后12d极显著减少(p<0.01);TLR-21表达量在攻毒后5d无显著变化,在攻毒后12d极显著增加(p<0.01),TGF-β1的表达量在攻毒后第5天、12天均极显著下调(p<0.01),表明病原菌或毒素因子突破回肠粘膜,并激活了免疫细胞的免疫应答反应。(3)攻毒后回肠粘膜免疫相关因子检测结果表明:α干扰素(IFN-α)的表达量在攻毒后5d和12d显著上调(p<0.05);γ干扰素(IFN-γ)的表达量在攻毒后5d和12d均极显著上调(p<0.01);白细胞介素-15(IL-15)的表达量在攻毒后5d极显著上调(p<0.01);白细胞介素-22(IL-22)的表达量在攻毒后12d极显著上调(p<0.01);白细胞介素-17A(IL-17A)的表达量在攻毒后5d显著上调(p<0.05)。(4)变形菌门的大肠杆菌丰度在攻毒后5d和12d极显著上调(p<0.01),均超过40%。丁酸含量在攻毒后5d和12d均极显著增加(p<0.05),刺激肠上皮细胞大量产生大肠杆菌毒素受体蛋白(GB3)。本研究表明的肉鸡感染H9N2 AIV继发大肠杆菌的机制为:肉鸡感染H9N2 AIV后,肉鸡肠道微生物结构和组成改变,大肠杆菌急剧增加,回肠绒毛结构破坏,炎症反应加剧,黏液层蛋白减少,有利于大肠杆菌从肠腔附着于粘膜;肠道炎症又使得丁酸含量上调,丁酸促进大肠杆菌毒素受体表达量增加,毒素更容易进入肠上皮细胞,同时由于肠道紧密连接破坏,肠上皮细胞旁通路通透性增强,病原菌及毒素因子等可以通过旁通路到达其他组织器官,使得炎症更加严重。炎症环境反过来又进一步促进大肠杆菌的增殖。