本论文对米胚谷氨酸脱羧酶(GAD)的分离纯化、酶学特性、光谱性质和氨基酸残基的化学修饰等进行了深入的研究,并应用米胚GAD及其活性调节机制制备了高γ-氨基丁酸(GABA)米胚。首先研究了米胚中GABA的测定方法,结果发现比色法误差较大,无法作为米胚中GABA的定量测定方法。而纸层析法精密度高,虽然比HPLC?法的测定结果略低,但差异不大,适合用于大量米胚样品的测定。通过(NH4)2SO4分级沉淀、DEAE-Sephrose FF离子交换色谱、Superdex 200 凝胶过滤色谱和Glu Sephrose CL 4B亲和色谱等分离纯化技术对米胚GAD进行了分离纯化,从米胚中分离得到的GAD经 SDS-PAGE鉴定为单一组分。体积排阻高效液相色谱测得米胚GAD的相对分子质量为78k,SDS-PAGE测得其亚基的相对分子质量为40k,因此米胚GAD酶蛋白是由两个相同的亚基构成的二聚体。米胚GAD的最适反应温度为40℃,最适反应pH为5.6。米胚GAD的热稳定较差, 75℃时酶基本完全失活。但米胚GAD在较宽的pH范围内(pH4.5-8.0)都较为稳定,能保持88%以上的酶活。米胚GAD对Glu的Km值为32.3mmol/L,Vmax为1.159mg/min;对PLP的Km值为1.7μmol/L ,Vmax为1.171mg/min。Ca2+浓度达到500μmol/L时对米胚GAD的激活作用最强,可使酶的相对活性达到145%,GAD的表观米氏常数 Km’为25.9mmol/L,小于米胚GAD对 Glu的Km,说明Ca2+提高了酶与底物的亲和力,对米胚GAD的活性确有较强的激活作用。在含PLP体系中,纯化的GAD的酶活性大大提高。GAD脱辅基后酶活完全丧失了,但是加入PLP后活性基本得以恢复,说明PLP从米胚GAD分子中的脱除是一个可逆过程。米胚GAD的紫外-可见光谱特征为除280nm以下与蛋白质有关的吸收峰以外,420nm处有一个弱吸收峰,这是PLP与米胚GAD主链结合后产生的吸收峰。米胚GAD的荧光光谱分析表明,米胚GAD主要表现为Tyr残基的荧光特征,米胚GAD脱辅基前后的荧光发射光谱完全相似。米胚GAD氨基酸残基的化学修饰研究表明,米胚GAD中的His残基与其酶活性有关,但可能不是其活性所必需的基团。Arg残基则是酶活性的必需基团,并且整个酶分子中有一个Arg残基为活性必需基团。底物GLu对Arg残基的修饰有着很强的保护作用,因而可推测说明Arg残基可能位于酶的底物结合位点。米胚GAD的His和Arg残基被修饰后,荧光发射光谱有着非常相似的变化,Trp残基的荧光发射基本被猝灭了,说明酶蛋白微区的<WP=10>构象发生了变化。CD光谱分析表明,米胚GAD的二级结构中, α-螺旋占13.2%,β-折叠占38.3%,是一种高β-折叠蛋白。米胚GAD脱辅基后蛋白质的二级结构的变化是部分β-折叠结构转变为了回转结构。His和 Arg残基被修饰后,酶蛋白的二级结构有较大的变化,底物对Arg残基修饰引起的结构变化有保护作用。分析米胚GAD二级结构的变化与酶活性的关系发现,米胚GAD二级结构中α-螺旋结构的维持对酶的活性可能更为重要。通过对水浸泡工艺进行优化,并利用Ca2+激活GAD,米胚中GABA的量可以由未富集前的28mg/100g提高到615mg/100g左右,比资料报道有较大提高。 利用胰蛋白酶水解可以进一步提高GABA的富集量,在最佳条件下,GABA产量可达2.3g/100g,比GABA-RG1提高了2倍。外加Glu和添加米胚GAD的激活剂是制备高浓度GABA的有效方法。最佳工艺条件是:pH5.6、0.08mol/L磷酸缓冲液, PLP和Ca2+的添加量分别为2 mmol/molGlu和20mmol/molGlu,米胚的用量为42.5U/mmolGlu,料液比为1/10,反应时间和温度为6h和40℃。产品中GABA含量为20.6g/100g,比GABA-RG2又提高了7.8倍,并且Glu的转化率可以达到100%。动物实验表明, GABA-RG可显著促进小鼠GH的分泌和后腿肌重的增长,对小鼠力竭游泳时间和爬杆时间有显著地延长作用。还可使运动后小鼠血乳酸的含量明显下降,血清尿素氮含量明显降低,肝糖原含量的显著提高。这些结果表明 GABA-RG能促进小鼠GH分泌并提高运动能力。根据国家卫生部关于保健性食品的评价指标,可以判定GABA-RG具有抗疲劳的作用。