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目的：探讨何首乌饮对衰老大鼠生精细胞胰岛素信号通路IRS1、IGF-1、IGFBP3基因表达的影响。 方法： 一、体内实验 1．实验分组及处理选用30只清洁级12月龄Wistar雄性大鼠随机分为：青年对照组(YCG)，自然衰老组(NAG)，何首乌饮组(SWYG)，每组各10只。青年对照组适应性饲养一周后取材；自然衰老组在饲养到16月龄后灌胃等量蒸馏水60d；何首乌饮组在饲养到16月龄后，灌胃何首乌饮(4.8g/100g)60d；自然衰老组和何首乌饮组均于18月龄时取材，备用。 2．观察睾丸组织IRS1、IGF-1、IGFBP3基因表达采用免疫荧光染色观察IRS1、IGF-1、IGFBP3在睾丸组织的表达位置，Western blot和实时荧光定量PCR检测睾丸组织IRS1、IGF-1、IGFBP3蛋白和mRNA表达的变化。 二、体外实验 1．细胞的分离、纯化、培养和鉴定组合酶法分离细胞，Percoll梯度密度离心和差异贴壁法纯化细胞，利用苏丹Ⅳ染液鉴定支持细胞并计算支持细胞的纯度；分别利用碱性磷酸酶染色、孚耳根染色、HE染色鉴定生精细胞。 2．衰老模型的建立将培养至7d的生精细胞，加入终浓度为50μmol/L的H2O2和100μmol/L FeSO4，连续干预8h，换液，继续培养72h；采用β-半乳糖甘酶特异性染色试剂盒检测实验各组中生精细胞β-半乳糖甘酶的表达情况，以判断衰老模型是否建立成功。 3．实验分组及处理根据实验目的分为：正常对照组(NCG)，将培养至7d的生精细胞，继续培养80h；衰老模型组(AMG)，将培养至7 d的生精细胞，加入终浓度为50μmol/L的H2O2和100μmol/L的FeSO4，连续干预8h，换液，继续培养72h；何首乌饮组(SWYG)，将培养至7d的生精细胞，加入终浓度分别为50μmol/L的H2O2和100μmol/L FeSO4，连续干预8h，换液，加入终浓度为10％的何首乌饮含药血清，继续培养72h。 4．采用Western blot和实时荧光定量PCR检测基因IRS1、IGF-1、IGFBP3在生精细胞的蛋白表达变化以及其mRNA的相对表达水平。 结果： 一、体内实验结果 1.免疫荧光检测结果IRS1阳性产物发红色荧光，定位在细胞膜，细胞核采用DAPI染色呈蓝色，IRS1阳性产物主要表达在精母细胞、支持细胞和肌样细胞。与青年对照组相比，自然衰老组IRS1阳性率明显降低(P＜0.01)，何首乌饮干预后，与自然衰老组相比，何首乌饮用药组IRS1阳性率明显升高(P＜0.01)。IGF-1阳性产物发绿色荧光，定位在细胞质，细胞核采用DAPI染色呈蓝色，IGF-1阳性产物主要表达在精子细胞。与青年对照组相比，自然衰老组IGF-1阳性率明显降低(P＜0.01)，何首乌饮干预后，与自然衰老组相比，何首乌饮用药组IGF-1阳性率明显升高(P＜0.01)。IGFBP3阳性产物发绿色荧光，定位在细胞质，细胞核采用 DAPI染色呈蓝色，IGFBP3阳性产物在精原细胞和少量间质细胞均有表达。经统计分析，与青年对照组相比，自然衰老组IGFBP3阳性率明显升高(P＜0.01)，何首乌饮干预后，与自然衰老组相比，何首乌饮用药组阳性率明显降低(P＜0.01)。 2.Western blot检测结果结果显示，与青年对照组相比，自然衰老组IGFBP3表达明显增加(P＜0.01)，IRS1、IGF-1表达明显减少(P＜0.01)；与自然衰老组相比，何首乌饮用药组IGFBP3表达量明显减少(P＜0.01)，IRS1、IGF-1表达量明显增加(P＜0.01)。 3.qRT-PCR检测结果结果显示，与青年对照组相比，自然衰老组IGFBP3 mRNA表达明显上调(P＜0.01)，IRS1、IGF-1的表达明显下调(P＜0.01)；与自然衰老组相比，何首乌饮用药组IGFBP3表达明显下调(P＜0.01)，IRS1、IGF-1的表达明显上调(P＜0.01)。 以上结果表明，何首乌饮可以通过调节胰岛素信号通路关键基因 IRS1、IGF-1、IGFBP3的表达延缓大鼠睾丸组织的衰老，为了进一步分析何首乌饮对衰老大鼠生精功能的调控机制，我们采用支持细胞和生精细胞共培养的方法，检测基因IRS1、IGF-1、IGFBP3在生精细胞的表达变化。 二、体外实验结果： 1.苏丹Ⅳ染色结果显示支持细胞纯度可达90%以上。 2.β-半乳糖甘酶特异性染色结果β-半乳糖甘酶特异性染色结果显示，β-半乳糖苷酶阳性产物定位在生精细胞质中。衰老模型组β-半乳糖苷酶阳性率明显高于正常对照组（P＜0.01）；何首乌饮含药血清干预后，与衰老模型组相比，何首乌饮组阳性率明显降低（P＜0.01）。 3.Western blot检测结果Western blot检测生精细胞IRS1、IGF-1、IGFBP3蛋白表达结果显示，与正常对照组相比，衰老模型组IRS1、IGF-1表达下调，IGFBP3表达上调(P＜0.01)，何首乌饮含药血清干预后，与衰老模型组相比，何首乌饮组IRS1、IGF-1表达上调，IGFBP3表达下调(P＜0.01)。 4.qRT-PCR检测结果 qRT-PCR检测生精细胞IRS1、IGF-1、IGFBP3在 mRNA水平的改变，与正常对照组相比，衰老模型组IRS1、IGF-1的表达明显下调(P＜0.01)，IGFBP3的表达上调(P＜0.01)；何首乌饮含药血清干预以后，与衰老模型组相比较，IRS1、IGF-1的表达明显上调(P＜0.01)，IGFBP3的表达有所下调(P＜0.01)。 结论： 1.何首乌饮可以通过提高衰老大鼠睾丸组织胰岛素通路关键基因IRS1、IGF-1的表达，抑制IGFBP3的表达，延缓大鼠睾丸组织的衰老。 2.何首乌饮能够降低衰老标志物β-半乳糖苷酶在生精细胞的表达。 3.何首乌饮可以通过促进生精细胞胰岛素通路关键基因IRS1、IGF-1的表达，抑制IGFBP3的表达，延缓大鼠生精细胞的衰老。 综上所述，何首乌饮通过调节胰岛素信号通路关键基因IRS1、IGF-1、IGFBP3的表达延缓大鼠睾丸组织生精细胞的衰老。