本课题主要进行了两部分内容的研究。　　1.一种GC碱基特异诱变方法的建立　　体外定向进化技术对于研究蛋白质结构与功能、改良蛋白质的性质，如活性、热稳定性、溶解性、表达量、底物特异性等具有独特的作用。一般说来，定向进化技术包括两个关键的步骤：目标基因多样性文库的构建和灵敏高效的筛选方法。其中前者主要是对目标基因进行随机诱变或体外重组，然后将其克隆到一定的宿主内表达，使之产生与原始基因不同的性状。目前用于随机诱变和体外重组的方法主要有易错PCR法、碱基类似物法、诱变菌株法、化学诱变法、DNA改组、交错延伸重组、过渡模板随机嵌合生长等。这些方法各有各的优点和缺点，从而能适用于不同的基因突变要求。然而目前尚无一种方法是针对富含GC基因的诱变。　　本课题中，我们结合亚硫酸氢钠化学修饰和PCR的方法建立了一种频率可控的GC碱基特异诱变技术。其主要过程为，先将已纯化的待诱变目标基因用亚硫酸氢钠进行处理，使其中部分胞嘧啶（C）脱氨基成尿嘧啶（U），得到含有尿嘧啶的杂合DNA分子。再以修饰后的DNA为模板进行PCR扩增，使其中的尿嘧啶（U）与腺嘌呤（A）配对，从而最终导致GC向AT的突变。　　我们调查了亚硫酸氢钠处理时间与最终突变率的关系，发现突变频率随处理时间的延长而增加，经过1 h，2 h，4 h，8 h和16 h的处理后，目标基因的碱基突变频率分别从0.55%达到4.34%，氨基酸突变率从1.06%升高至6.97%，因此采用该方法可以仅仅通过控制亚硫酸氢钠处理时间来控制最终的突变频率。而且与预期结果一致，产生的突变中绝大部分是GC向AT的突变，占所有突变的90%以上，这一点对富含GC基因的诱变特别有效。经过这种方法诱变后，目标基因的GC含量显著降低，这个特性对于富含GC基因的定向进化非常有用，可以避免突变后在原核宿主中因为GC含量过高导致表达困难的问题。而且对突变位点的分布情况分析表明，这种方法引起的突变均匀分布于目标基因，没有明显的突变热点，符合定向进化实验的要求。　　利用该方法对编码β-内酰胺酶的bla基因进行了诱变，建立了多样性文库，并且成功的从中筛选到7个底物特异性改变的突变体，证实我们建立的诱变方法完全可以应用于定向进化实验。　　2.细菌群体感应系统的研究。　　许多细菌通过分泌一种小的可扩散的信号分子来感应周围环境中的种群密度，从而控制相关基因的表达，协调群体的行为来适应环境的变化，这种现象被称为“群体感应”（Quorum sensing）。革兰氏阴性细菌的群体感应绝大多数都是由一种N-酰基高丝氨酸内酯（N-acyl homoserine lactone，AHL）的小分子物质介导，其关键的调控机制是在生长过程中，细菌能分泌 AHL信号分子，这些信号分子可以自由穿梭于细胞内外，从而保持相同的浓度。随着细菌的生长繁殖，AHL分子的浓度逐渐升高，直到达到某一阈值浓度时，AHL分子能与细菌产生的一种LuxR类受体蛋白结合，形成AHL-LuxR类复合体，这样的复合体是一种调控因子，可以识别并结合特异启动子上游的一段完全或部分回文结构的DNA序列（被称为lux box），从而激活启动子下游基因的转录表达。　　群体感应系统调控着许多细菌的生理行为，如生物发光、质粒的结合转移、毒素的产生、抗生素的合成和生物膜的发育等，尤其是很多致病菌的致病能力都由群体感应系统调控。因此对于群体感应机制的深入研究具有重要的意义。　　另一方面，在群体感应中扮演了关键的角色 AHL分子对于一些致病菌的致病能力具有重要作用，因此，通过限制 AHL分子的浓度进而防治致病菌的侵染已经成为一种新的植物性病害防治策略，因此寻找降解 AHL分子的细菌和酶用于生防菌或转基因植物的构建具有重大的应用价值。　　在本课题中，我们对中国海洋微生物菌种保藏管理中心（MCCC）提供的部分细菌进行了产AHL类信号分子能力和降解AHL分子能力的检测，从中首次发现一株名为Pseudaminobacter salicylatoxidans的革兰氏阴性细菌具有群体感应调控现象，并且发现其 AHL分子的产生随培养时间的增加而增加，在指数生长期达到最高浓度，并在接下来的稳定期内维持较高的浓度。另外，我们筛选到7株具有降解AHL分子能力的细菌，分别为柴油食烷菌（Alcanivorax dieselolei），红细菌（Rhodobacter sp.），假交替单胞菌（Pseudoalteromonas byunsanensis），盐单胞菌（Halomonas sp.），除烃海杆菌（Marinobacter hydrocarbonoclasticus），食烷菌（Alcanivorax venusti）， Martelella mediterranea（暂无中文译名），其中除红细菌外，其它6株都是首次发现具有AHL降解活性。对这7株菌降解AHL的性质进行了初步的分析研究，发现其中的柴油食烷菌，红细菌和盐单胞菌产生的 AHL降解酶活性很高，而且能分泌到细胞外，具有很大的研究价值。　　在研究群体感应系统过程中，我们发现现有的 AHL生测菌株都有这样那样的不足之处，尤其是在用生测菌株对构建的 AHL降解酶基因文库筛选时，要求非常复杂的操作和昂贵的化学试剂，因此我们根据群体感应的机理，利用费氏弧菌的调控元件luxR基因和Plux启动子以及来自枯草芽孢杆菌的甘露聚糖酶基因构建了一株新的生测菌株 E.coli ALM403，并根据甘露聚糖酶的性质建立了刚果红染色和DNS法两种方法用于检测AHL分子，我们的研究证明，新的生测菌株能对AHL分子具有良好的应答能力，表现出容易检测的性状，可以用于AHL分子的检测。