外被体蛋白Ⅱ对猪瘟病毒复制的影响

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内质网蛋白的输出是由外被体蛋白Ⅱ(coat protein complexⅡ,COPⅡ)包被的囊泡介导的,前期研究发现敲低 COPⅡ运输途径的调控蛋白 Rab1,猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)的复制受到显著的抑制,说明Rab1及其调控的运输途径在CSFV的复制过程中有重要作用。为了进一步了解 COPⅡ运输途径对 CSFV 复制的影响,探究COPⅡ蛋白转运过程在CSFV复制中的作用,本研究利用COPⅡ途径的抑制剂H89处理宿主细胞,在不同的时间点检测CSFV RNA、E2蛋白以及病毒感染力的变化。过表达和干扰COPⅡ复合体中的蛋白Sar1b、Sec13和Sec23,并构建相应的稳转细胞系,进一步检测COPⅡ运输途径对猪瘟病毒复制的影响并确定影响的关键蛋白,同时利用重叠延伸 PCR 构建关键蛋白 Sar1b 的激活性突变体和失活性突变体,进一步研究 Sar1b 对CSFV复制的影响,获得以下研究结果:  (1)COPⅡ蛋白Sar1b、Sec13和Sec23促进CSFV的复制过程。成功构建Sar1b、Sec13和Sec23基因的过表达细胞系,CSFV接种过表达细胞系,发现过表达Sar1b、Sec13和Sec23均会引起CSFV RNA和E2蛋白表达量的增加,并且会引起CSFV感染早期病毒粒子释放量的增加。其中过表达Sar1b对其影响极显著(P<0.01)。构建分别针对Sar1b、Sec13和Sec23 的重组慢病毒干扰细胞系,CSFV感染这些细胞系后,病毒增殖均受到显著抑制(P<0.05),其中CSFV的复制在干扰Sar1b的细胞系中受到显著抑制(P<0.01),说明COPⅡ蛋白Sar1b、Sec13和Sec23促进了CSFV的复制过程。  (2)COPⅡ运输途径影响CSFV的感染力。通过MTT试验确定了COPⅡ途径抑制剂H89对PK-15细胞的安全作用浓度。CSFV感染H89处理后的细胞,在不同时间点检测CSFV的复制水平和感染力变化。结果显示抑制剂H89处理后,CSFV的RNA水平显著降低(P<0.05),结构蛋白E2的表达量也显著减少(P<0.05),说明抑制COPⅡ运输途径会抑制CSFV基因组RNA的复制和E2蛋白的合成。有趣的是,H89处理的细胞在 CSFV 感染早期释放病毒粒子显著增多(P<0.01),而病毒感染力下降,说明H89所抑制的COPⅡ运输途径会影响CSFV的感染力。  (3)Sar1b的激活促进CSFV的复制。利用重叠延伸PCR方法扩增关键蛋白Sar1b的激活性突变体Sar1b[H79G]和失活性突变体Sar1b[T39N],并构建突变体的稳转细胞系。CSFV感染该细胞系,发现表达激活性突变体Sar1b[H79G]时,CSFV基因组RNA相对复制量和E2蛋白的表达水平显著增加(P<0.05);表达失活性突变体Sar1b[T39N]时CSFV的增殖受到极显著的抑制(P<0.01),说明Sar1b蛋白的激活促进CSFV复制。重要的是,在CSFV感染早期,发现激活性突变细胞系和失活性突变细胞系的病毒粒子的释放量均极显著降低(P<0.01),说明COPⅡ运输途径促进CSFV病毒粒子的组装或释放过程。  (4)CSFV感染PK-15细胞会调控COPⅡ蛋白的表达。real-time PCR和Western blot检测Sar1b、Sec13和Sec23的表达水平,发现CSFV感染早期会抑制Sar1b、Sec13和Sec23的表达,以Sar1b表达变化最为显著(P<0.01)。进一步说明COPⅡ促进CSFV的复制过程,Sar1b是促进CSFV复制的关键蛋白。  综上所述,本研究明确了COPⅡ蛋白复合体促进CSFV复制的过程,COPⅡ介导的蛋白运输途径促进CSFV的组装或释放,为进一步探索COPⅡ在CSFV复制中的作用奠定了基础,为全面了解CSFV复制机制和生命周期提供了新的科学依据。
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