棉铃虫单核多角体病毒基因(HaSNPV)是一种重要的几丁质酶相关基因,该基因表达产生的几丁质酶对鳞翅目、鞘翅目昆虫体表和体内围食膜中几丁质和真菌细胞壁中几丁质具有特异分解作用,对昆虫与真菌的生长繁殖具有抑制甚至杀灭作用,在农作物病虫害的生物防治领域具有重要作用。重组毕赤氏酵母GS115-pPIC9k-ChiA4.0是将HaSNPV几丁质酶基因构建到真核表达载体pPIC9K中,并转化至巴斯德毕赤氏酵母(Pichia pastoris) GS115而获得的,所构建的重组细胞具有巴斯德毕赤氏酵母的所有优点,能够在甲醇的唯一诱导下产生胞外HaSNPV几丁质酶,对昆虫几丁质具高度专一的降解活性,为农业病虫害的防治起到重要的作用。为了充分发挥细胞重悬过程产酶上的优势,利用微胶囊可在无外力作用下沉降实现细胞与培养液分离的优势,减少典型发酵过程中转换阶段的工作量。本文利用海藻酸钠/壳聚糖(alginate/chitosan, AC)微胶囊包埋重组细胞进行微囊化发酵,主要考察了AC微胶囊对模型蛋白质的通透性及微囊化过程对基因工程菌GS115-pPIC9k-ChiA4.0生长代谢的影响。主要结论如下：1.AC微胶囊对蛋白质的通透性随着蛋白质分子量的增加而降低,达到扩散平衡时平衡分配系数越高,截留系数越小。微胶囊成膜条件的变化对微胶囊的通透性具有重要的影响。其中,随着参与成膜反应壳聚糖溶液浓度越高,微胶囊膜越厚且越致密,微胶囊通透性降低；随着覆膜时间的增加,参与成膜反应的物质的量越多,微胶囊的通透性降低；随着壳聚糖分子量的增加,微胶囊膜越致密,微胶囊通透性能降低。因此,可以通过改变成膜条件,使产物几丁质酶顺利透出。2.微胶囊对重组毕赤酵母细胞有良好的生物相容性,细胞能在囊内良好生长,但由于微胶囊膜对底物和氧气传递的扩散阻力,微胶囊内细胞的生长代谢均滞后于游离细胞,在细胞生长初期会出现一段明显的生长停滞阶段。3.微囊化细胞与游离细胞相比,具有相似的生长代谢规律,微胶囊在培养过程中形态完好无破损。制备条件对微胶囊化细胞生长的影响主要是与微胶囊的通透性有关,微胶囊通透性越好,细胞生长状况越好；同时,微胶囊内核体积的大小也会对细胞生长量产生影响。发酵产物电泳也表明了几丁质酶的顺利生成。4.由正交试验和方差分析确定的最佳微胶囊成膜条件为：覆膜时间为10min,壳聚糖分子量为50kDa,壳聚糖浓度为3g/L。对正交试验获得的最佳工艺条件进行了验证,在该工艺条件下,几丁质酶产量高达133.8U/mL,高于其他条件下的产量,且与悬浮细胞发酵所获得的的几丁质酶活最为接近。5.几丁质膜降解实验表明,微囊化细胞发酵产生的几丁质酶对几丁质具有良好的催化活性,即产物将会对昆虫表现出良好的触杀毒性。总之,壳聚糖/海藻酸钠微胶囊可以作为重组毕赤氏酵母GS115-pPIC9k-ChiA4.0细胞培养的理想反应器,为生物农药——几丁质酶的大规模发酵具有重要的意义。