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普瑞巴林(Pregabalin,PGB),化学名为(S)-(+)-3-氨甲基-5-甲基己酸,是抑制性神经递质γ-氨基丁酸(GABA)的3-位异丁基取代物。普瑞巴林首先用于治疗外周神经痛以及辅助性治疗局限性部分癫痫发作,后增加了多种适应症。据统计,普瑞巴林2013年的销售额达到45.95亿美元,具有广阔的市场前景。由于普瑞巴林R型异构体活性仅为其S型异构体的1/10,光学纯S型异构体的高效合成对提高药物疗效,减少用量,减轻非对映体的副作用等方面均有重要的意义。腈水解酶(Nitrilase,EC3.5.5.1)是一类重要的腈转化酶,经一步反应直接将腈化合物水解生成相应的羧酸和氨。腈类化合物的酶法水解具有高效性和高选择性,同时其反应条件温和、环境污染小,因此符合原子经济和绿色化学发展的方向。异丁基丁二腈(IBSN)经区域和立体选择性水解合成(S)-3-氰基-5-甲基己酸,再加氢还原制备(S)-(+)-3-氨甲基-5-甲基己酸是诸多普瑞巴林化学-酶法合成工艺中原子经济性最优的路线,其难点在于获得对IBSN具有高活性和高选择性的腈水解酶。本研究根据Alcaligenes faecalis ZJUTB10腈水解酶的二级结构,对其进行同源建模、底物与酶分子对接研究,选取四个位点(Y296,A197,1289和L175)进行饱和突变,在分子水平上对其进行改造。但所选位点的突变未能使该腈水解酶的选择性得到显著提高。因此进一步对本实验室的腈水解酶库进行筛选,得到一株重组大肠杆菌E.coli BL21/pET28b-NIT(NIT),其腈水解酶基因来源于拟南芥(Arabidopsis thaliana)。该重组菌在150 mM底物,pH 7.0和30℃下转化4 h,底物转化率和产物e.e.值分别达到42%和96%。通过单因素实验考察了各种反应条件对NIT催化拆分的影响。结果表明,其最佳反应条件为:pH 8.0 Tris-HCl(100 mM),250 mM IBSN,20 g/L湿菌体,30℃。在优化条件下,NIT能够高选择性、高效率地水解IBSN生成(S)-3-氰基-5-甲基己酸,反应4h后,底物转化率和产物e.e.值分别达到43%和95%。在500 L发酵罐上对E.coli BL21/pET28b-NIT进行发酵培养,该菌株发酵培养3 h进入对数生长期,10.5 h进入衰亡期;在底物浓度为450 mM时,在最适反应温度和pH下反应8 h,反应的底物转化率和产物e.e.值分别达到42%和95%。纯化后产物的纯度和e.e.值分别达到97%和98%。