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AP-1是一种重要的转录因子,其活性失调与肿瘤等多种疾病直接相关。利用AP-1荧光素酶报告基因筛选,发现人ac3-33基因可抑制佛波酯和离子霉素(PMA+Ionomycin)共同诱导的AP-1转录活性。ac3-33(GenBank name:C3orf33, Accession No. FLJ31139)基因在人各种组织中不同程度表达,亚细胞定位显示AC3-33蛋白在细胞质中表达。ac3-33基因在人白血病细胞系K562和KGla中显著低表达,ac3-33可能在AP-1活性调节方面起到至关重要的作用,阐明ac3-33的分子机制将为某些疾病的诊断和治疗提供重要理论基础。本课题旨在对ac3-33进行基因克隆、原核表达载体构建、GST-AC3-33融合蛋白的表达和纯化进行研究,为其功能鉴定奠定基础。实验设计含Xho Ⅰ、BamH Ⅰ酶切位点的一对引物,并以pcDB-TOPO-ac3-33质粒为模板进行PCR扩增,纯化回收得到ac3-33基因片段。纯化回收得到的ac3-33片段与pGEX-4T-1载体连接,转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,在含有Amp的LB固体培养基上培养,挑取单菌落、提取和纯化回收质粒、并对重组子进行特异引物扩增、限制性内切酶酶切和测序鉴定。融合蛋白GST-AC3-33在DH5α中以可溶和包涵体两种形式表达,实验主要对可溶形式的融合蛋白进行研究。为使融合蛋白高效并主要以可溶形式进行表达,实验研究了培养基、NaCl浓度、pH、IPTG浓度、诱导温度、诱导时间等对重组融合蛋白表达的影响。结果显示：用pH7.0,0.2%NaCl的LB培养基,37℃培养到OD600为1.0左右,用浓度为0.5mM的IPTG于30℃诱导5-6h,融合蛋白能获得高效表达。同时研究了细胞破碎方法和洗脱液浓度等对融合蛋白纯化的影响。结果显示：用细胞裂解液溶解细胞沉淀,用反复冻融、酶解和超声波破碎三种方法结合破碎细胞,释放蛋白,然后用高亲和GST树脂纯化融合蛋白,用10mM的还原性谷胱甘肽进行洗脱,得到融合蛋白的浓度约为0.32mg/mL。