随着现代分析技术、分子生物技术的迅速发展，代谢组学、蛋白质组学、基因组学等的出现，为中药效应物质的研究提供了很多技术与方法参考，但如何从整体角度出发，更准确地反映中药内在的活性物质还存在一定的难度，本研究在基因敲除和生物色谱技术的启发下，意图利用制备液相色谱技术对中药中某些成分进行剔除，并结合多指标综合评价，从而进行中药效应物质的辨识，在阐明活性成分的同时进一步判别活性成分的效应贡献。　　本论文研究工作为国家科技支撑项目项目——“中药有效成分群关键技术研究”的部分实验内容。　　论文共分为四章，第一章首先探讨了对中药药效物质的认识，在此基础上，系统地综述了中药药效物质传统与现代研究思路与方法。第二章至第四章为实验部分，具体研究内容和相关结论如下:　　第二章基于选择性剔除比较阿魏酸在归芎组对前后抗氧化活性的作用贡献。以当归-川芎药对及其组成药味为研究对象，建立一种探索同一成分在不同中药中效应贡献差异性的研究方法，进而阐明中药整体研究的重要性。采用制备液相色谱分别剔除当归、川芎及归芎药对中的阿魏酸，然后对剔除阿魏酸前后溶液抗氧化活性进行比较，进而比较阿魏酸在药对及其单味药中的作用贡献大小。　　第一节归芎药对及其单昧药中阿魏酸的剔除。采用制备液相色谱对当归-川芎药对及其组成药味中阿魏酸进行选择性剔除，并用分析型高效液相色谱对剔除前后溶液及剔除成分进行分析。分析结果表明，三者中阿魏酸均被较好的剔除，且获得了一定量的剔除阿魏酸后的样品，以便用于后续活性评价。　　第二节归芎药对及其单味药剔除阿魏酸前后体外抗氧化活性比较评价。采用DPPH自由基清除法，比较原方（剔除阿魏酸前）、剔除方（剔除阿魏酸后）以及还原方（在剔除方中加入一定量阿魏酸使其含量与原方中一致）抗氧化活性。结果显示，剔除方加入与原方相同浓度的阿魏酸后，其抗氧化活性无显著性差异，说明从抗氧化活性上看，阿魏酸亦基本满足剔除要求。比较原方与剔除方，结果显示，原方剔除阿魏酸后，归芎药对及其单味药抗氧化活性均有明显下降，结果表明阿魏酸应为归芎药对及其单味药抗氧化活性主要效应物质，其作用大小比较为:DG＞CX＞GX;而剔除方本身仍具有较强抗氧化活性，结果表明除阿魏酸外归芎药对抗氧化活性中还存在其他贡献性成分。对阿魏酸在当归、川芎、归芎药对中的抗氧化活性的作用做进一步比较，在剔除溶液的基础上研究了不同浓度阿魏酸在归芎药对及其单味药中的抗氧化活性。结果显示，阿魏酸在归芎药对及其单味药中抗氧化作用方面与剂量相关，在测定浓度下，它们的剂量效应曲线作用趋势一致，说明阿魏酸在当归、川芎和归芎中的抗氧化活性方面起到重要作用，其作用大小比较:当归＞川芎≈归芎药对，这也进一步证实了阿魏酸在当归中的作用比在川芎和归芎中的作用要大。　　本章研究将提供一种用于阐明相同成分在不同中药中生物活性作用比较的有效方法，为后续研究奠定了基础，也为制备液相研究中药复杂成分引导了一个新的方向。　　第三章基于选择性剔除的红花效应物质辨识与评价。以红花为例，建立一种从整体角度研究中药药效物质的方法。利用制备液相色谱选择性剔除其主要成分，然后分别对剔除前后的样品进行效应评价，进而比较分析得出红花不同活性的主要效应物质及各成分的贡献度。　　第一节红花中多种成分的剔除。采用制备液相色谱对红花中主要成分进行剔除，并用分析型高效液相色谱对剔除效果进行随行分析。结果共剔除13个成分，高效液相分析结果表明，剔除率均在85％以上，达到剔除要求，用该方法共获得26个样品，分别是分别剔除13个成分外的剔除后溶液（HH1-HH13），以及剔除的13个目标成分(C1-C13)。采用HPLC-Q-TOF-MS对剔除成分进行分析，获得相应质谱数据。基于紫外和质谱数据、对照品对照以及现有研究文献对照，对剔除成分分别进行结果鉴定，结果共鉴定了其中11个成分，分别为胞苷(1)、腺苷(2)、羟基红花黄色素A(3)、6-羟基山柰酚-3，6-二氧葡萄糖-7-氧葡萄糖醛酸苷(5)、6-羟基山柰酚-3，6，7-三氧葡萄糖苷(6)、6-羟基芹菜素-6-氧葡萄糖-7-氧葡萄糖醛酸苷(7)、6-羟基山柰酚-3，6-二氧葡萄糖苷和6-羟基山柰酚-3-氧芸香糖-6-氧葡萄糖苷的混合物(8)、脱水红花黄色素B(9)、6-羟基山柰酚-3-氧芸香糖苷(10)和山柰酚-3-氧芸香糖苷(11)。剔除成分4、12和13由于数据不足未能鉴定。　　第二节红花体外药理活性研究。为选择合适的效应评价指标及合适的浓度用于后续活性比较研究，对红花活血效应（对家兔血小板聚集功能及凝血功能的影响）、抗氧化活性（DPPH自由基清除活性、ABTS自由基清除活性、Fe3+还原能力和羟自由基清除活性）、通经相关活性（对小鼠离体子宫收缩的影响、对大鼠卵巢颗粒细胞增殖的影响）等进行评价。根据实验结果，最终选择0.59生药/mL浓度下进行抗ADP诱导的血小板聚集活性和APTT测定，选择0.7g生药/mL浓度下进行PAF诱导的血小板聚集、TT和PT测定，选择5 mg生药/mL进行红花剔除成分及剔除前后溶液的DPPH清除率测定和FRAP法测定，选择0.156mg生药/mL浓度下进行ABTS清除率测定，选择以2×106浓度的细胞种板，200μg生药/mL终浓度下进行大鼠卵巢颗粒细胞增殖实验研究。羟自由基清除活性和对小鼠离体子宫收缩的影响相对较弱，故未作为后续活性研究指标。　　第三节红花各成分剔除前后不同活性贡献度比较评价。在上述研究基础上，利用家兔血小板聚集活性、凝血功能、抗氧化活性和大鼠卵巢颗粒细胞增殖活性等指标比较评价红花主要成分效应贡献。　　（一）对家兔血小板聚集功能及凝血功能的影响。分别研究各样品对ADP和PAF诱导的血小板聚集的影响以及对PT、APTT、TT的延长作用，并采用多指标综合指数法对活血化瘀效应贡献进行整合。结果表明，成分5、6、8、10、12、13是红花抗ADP诱导的血小板聚集活性主要物质基础，作用贡献大小比较:13＞8＞10＞12＞6＞5;成分3、8、9、10、12、13是红花抗PAF诱导的血小板聚集活性主要物质基础，作用贡献大小比较:8＞13＞9＞12＞3＞10;成分2、7、8、9、11、12是红花中影响外源性凝血系统中相关凝血因子（延长PT）的主要物质基础，作用贡献大小比较:3＞10＞11＞6＞4＞9;成分3、9、10是红花中影响内源性凝血系统中相关凝血因子（延长APTT）的主要物质基础，作用贡献大小比较:10＞9＞3;成分1、3、4、6、10、11是红花中影响凝血系统纤维蛋白原转化（延长TT）的主要物质基础，作用贡献大小比较:10＞11＞3＞4＞6＞1。通过多指标综合指数法获得了各成分在红花中的总活血效应贡献值，综合考虑整合结果与不同指标的主要活性成分，初步确定红花活血效应的主要活性成分为3（羟基红花黄色素A）、8（6-羟基山柰酚-3，6-二氧葡萄糖苷和6-羟基山柰酚-3-氧芸香糖-6-氧葡萄糖苷的混合物）、9（脱水红花黄色素B）、10（6-羟基山柰酚-3-氧芸香糖苷），总活血效应贡献值大小顺序依次为:10＞9＞3＞8。　　（二）体外抗氧化活性贡献比较。采用三种抗氧化活性指标（DPPH自由基清除活性、ABTS自由基清除活性和Fe3+还原能力测定）共同评价红花中主要成分的作用及作用贡献。结果显示，成分1、3、4、5、8、9、10、11、12、13是红花清除DPPH自由基的主要活性成分，其贡献比较:4＞1＞8＞10＞12＞11＞5＞9＞3＞13;成分1、3、5、8、10、11是清除ABTS自由基的主要活性成分，其贡献比较:5＞3＞9＞10＞8＞1;红花中各主要成分被剔除后，其对Fe3+的还原能力均有显著降低，说明这些主要成分对红花Fe3+的还原能力方面均有一定作用，其贡献比较:10＞8＞9＞12＞11＞7＞6＞1＞13＞4＞3＞2＞5。通过多指标综合指数法获得了各成分在红花中的总抗氧化活性贡献值，综合考虑整合结果与不同指标的主要活性成分，结果表明红花抗氧化主要效应物质为1（胞苷）、4（未知）、8（6-羟基山柰酚-3，6-二氧葡萄糖苷和6-羟基山柰酚-3-氧芸香糖-6-氧葡萄糖苷的混合物）、9（脱水红花黄色素B）、10（6-羟基山柰酚-3-氧芸香糖苷）、11（山柰酚-3-氧芸香糖苷）、12（未知），总抗氧化效应贡献值大小顺序依次为:10＞8＞4＞1＞9＞11＞12。　　（三）对大鼠卵巢颗粒细胞增殖的影响。利用大鼠卵巢颗粒细胞增殖实验进一步评价红花中主要成分的作用及作用贡献。结果显示，成分除成分3和5外，其他成分对红花促进卵巢颗粒细胞增殖均有一定贡献，其贡献度大小比较:7＞6＞4＞11＞1＞8＞10＞9＞12＞13＞2。该部分研究一定程度上揭示了红花通经效应的药效物质基础，但目前指标单一，还有待进一步研究。　　本章研究采用选择性剔除技术与多指标效应综合评价相结合，探索了一种较新颖而有效的研究中药效应物质的方法，通过这种方法，我们能从一定程度上阐明不同成分对中药不同效应表达直接或间接的贡献以及贡献度，同时也能从一定程度上阐明中药的作用机制。　　第四章基于选择性剔除的红花系列药对中主要活血效应物质的剔除与效应贡献比较评价。以红花及其系列药对为例，建立一种从整体角度研究药对效应物质作用变化的方法。利用制备液相色谱选择性剔除其活血主要效应物质羟基红花黄色素A(HSYA)和脱水红花黄色素B(ASYB)，然后分别对剔除后的样品进行效应评价，进而比较分析得出红花不同配伍的主要效应物质贡献度变化。　　第一节红花系列药对中羟基红花黄色素A和脱水红花黄色素B的剔除。采用制备液相色谱对红花系列药对（红花-桃仁、红花-甘草、红花-红参、红花-当归、红花-苏木、红花-丹参、红花-黄芪和红花单味药）中羟基红花黄色素A和脱水红花黄色素B这两个成分分别进行剔除，并用分析型高效液相色谱对剔除效果进行随行分析。结果表明，剔除率均在85％以上，达到剔除要求，用这种方法获得了18个样品，分别是HSYA以及剔除HSYA后的样品红花(HH-1)、红花-当归药对(HD-1)、红花-黄芪药对(HQ-1)、红花-丹参药对(DH-1)、红花-苏木药对(HM-1)、红花-桃仁药对(HT-1)、红花-红参药对(HS-1)、红花-甘草药对(HG-1)，ASYB以及剔除ASYB后的样品红花(HH-2)、红花-当归药对(HD-2)、红花-黄芪药对(HQ-2)、红花-丹参药对(DH-2)、红花-苏木药对(HM-2)、红花-桃仁药对(HT-2)、红花-红参药对(HS-2)、红花-甘草药对(HG-2)。　　第二节红花系列药对主要活血效应成分剔除前后活性评价。在上述研究基础上，利用家兔血小板聚集活性、凝血功能等指标比较评价红花系列药对主要活血效应成分剔除前后贡献度变化。结果发现，羟基红花黄色素A和脱水红花黄色素B对红花及其系列药对活血效应均有一定贡献，HSYA在红花及其系列药对中的贡献度大小比较:HS＞HM＞HD＞HQ＞HT＞HG＞DH＞HH，ASYB在红花及其系列药对中的贡献度大小比较:HG＞HT＞HD＞HM＞DH＞HQ＞HS＞HH。这两个成分在红花及其系列药对中作用基本一致，但在不同配伍条件下作用大小有较大差异，且在不同效应指标中的作用贡献也不尽相同。　　本章研究采用制备液相剔除技术与多指标效应综合评价相结合，探索了一种较新颖而有效的研究药对效应物质变化的方法，可以从一定程度上阐明了药对配伍的变化，将有助于更好进行中药药对的研究。　　结论:本论文通过对归芎组对前后阿魏酸作用贡献比较以及红花及其系列药对多效应物质基础研究，建立了一种基于选择性剔除的辨识与验证技术，拓展了制备液相的使用方向，也为中药药效物质研究提供了一种新颖而有效的策略与方法。