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背景: 前列腺癌发病率不断上升，据统计2015年检出率在所有肿瘤中排第二，死亡率排第一，成为危害男性健康的恶性肿瘤。肿瘤常规三大疗法:手术、化疗、放疗。但常规疗法特异性不足，常常对正常器官和组织有损伤，损害了患者的生存质量。免疫治疗可以诱导机体免疫系统产生针对肿瘤的特异性反应，甚至能清除残余的肿瘤病灶，诱导机体免疫系统产生免疫记忆。 肿瘤细胞疫苗属于免疫疗法，完整的、灭活的肿瘤细胞包含肿瘤所有抗原，肿瘤特异性抗原刺激机体免疫系统，并产生针对此种肿瘤的特异性免疫反应。在肿瘤免疫中，T淋巴细胞应答具有至关重要的作用。但单独的肿瘤细胞往往对机体的刺激不足，难以介导抗原特异性的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)作用，在肿瘤细胞疫苗中往往会添加免疫佐剂，增强疫苗的免疫原性。GM-CSF和TNFα都是良好的免疫佐剂，能够很好地刺激粒细胞、巨噬细胞、尤其是树突状细胞的增殖、分化，增强机体免疫强度，而且二者有很好的免疫协同作用。 针对前列腺癌在发展和和治疗中易由雄激素依赖阶段演变为雄激素非依赖型的特性，已进入临床Ⅲ期试验的GVAX(R)前列腺癌疫苗利用LNCaP和PC-3两个细胞系作为抗原，LNCaP分泌总前列腺特异性抗原(tPSA)，具有前列腺癌肿瘤细胞早期分化的特征，用于抗早期雄激素依赖性的前列腺癌;PC-3作为雄激素非依赖性前列腺癌细胞，已被广泛用于雄激素抵抗型的前列腺癌的研究。但该疫苗的制备需要两种转基因细胞系的培养制备，工序复杂、成本高、耗时较长，若利用我们的细胞膜表面锚定修饰技术，而且能仅用一种细胞作为疫苗制备的抗原可以同时治疗激素依赖和非依赖的前列腺癌将会很大程度的改善这些问题。 我们前期工作中，验证了SA-hTNFa/hGM-CSF双重锚定修饰的LNCaP细胞疫苗对雄激素依赖的LNCaP前列腺癌疗效显著。此次，用PC-3细胞在hu-PBL-NOD/SCID小鼠皮下成瘤建造雄激素非依赖型前列腺癌模型，检验SA-hTNFa/hGM-CSF双重锚定修饰的LNCaP疫苗对雄激素非依赖前列腺癌的治疗效果，本实验将SA-hTNFa/hGM-CSF双重锚定修饰的PC-3细胞疫苗组作为参照实验组进行研究，研究显示SA-hTNFa/hGM-CSF双重锚定修饰的LNCaP疫苗与SA-hTNFa/hGM-CSF双重锚定修饰的PC-3细胞疫苗对雄激素非依赖的PC-3前列腺癌治疗效果无明显统计学差异。 综上说明SA-hTNFa/hGM-CSF双重锚定修饰的LNCaP疫苗既对雄激素依赖前列腺癌有治疗效果，又对雄激素非依赖前列腺癌有治疗效果。可得在整个前列腺癌治疗过程中可以用单一的LNCaP细胞系作为抗原制作肿瘤疫苗，与GVAX(R)前列腺癌疫苗需要制备两种细胞系相比，大大简化了肿瘤疫苗的制作流程，节约了时间和成本，并且疫苗批次间更加稳定。 目的: 1.SA-hGM-CSF和SA-hTNFα重组蛋白进行活性鉴定，及锚定率流式检测。疫苗表面锚定蛋白生物活性检测 2.建立具有人免疫系统的人外周血淋巴细胞-重度联合免疫缺陷小鼠嵌合体(hu-PBL-NOD/SCID)模型，鉴定小鼠是否发生移植物抗宿主病(graft-versus-host disease, GVHD)。 3.建立小鼠皮下肿瘤PC-3前列腺癌模型，比较SA-hTNFα/hGM-CSF双重锚定修饰的LNCaP细胞疫苗和SA-hTNFα/hGM-CSF双重锚定修饰的PC-3细胞疫苗在动物水平的抗肿瘤效果。 4.监测小鼠的体重、精神状态，对小鼠主要脏器进行HE染色，鉴定疫苗是否对小鼠有毒副作用。 方法: 1.蛋白活性检测:SDS-PAGE凝胶电泳鉴别SA-hTNFα蛋白SA-hGM-CSF蛋白的纯化复性状况。TNFα蛋白对小鼠成纤维细胞系L929有毒副作用，入红白血病细胞的生长增殖需依赖GM-CSF蛋白，我们通过梯度稀释这两种蛋白和锚定蛋白的疫苗检测对特异性细胞系生长增殖的影响来鉴定蛋白活性。 2.疫苗制作:将LNCaP细胞和PC-3细胞用30％酒精室温固定30min，1mg/ml生物素化试剂37℃孵育30min进行生物素化，将重组蛋白SA-hTNFα蛋白、SA-hGM-CSF蛋白室温孵育1h制成前列腺癌治疗性疫苗。利用流式细胞技术来检测两种重组蛋白的锚定效率，确定是否达到要求。 3.造模及疫苗效果检测:敲除NK细胞后的NOD/SCID小鼠腹腔注射4×107 PBMCs/只，建立嵌合体小鼠，4周后检测小鼠血液中hCD+4T细胞和hCD+8 T细胞。肋胁部皮下注射5×105PC-3前列腺癌细胞造模，此为观察期第0天。在第0、7、14天分别注射SA-hTNFα/ hGM-CSF双重锚定的LNCaP前列腺癌治疗性疫苗、SA-hTNFα/ hGM-CSF双重锚定修饰的PC-3前列腺癌治疗性疫苗、PBS。观察60天，每隔一天测肿瘤大小，比较这两种前列腺癌治疗性疫苗的抗肿瘤效果。60天观察期内，记录每组小鼠的生存曲线。观察期结束后，对小鼠肿瘤做免疫组化hCD+4 T细胞和hCD+8 T细胞染色，查看免疫浸润情况。对小鼠肿瘤进行Ki67染色，比较每组小鼠肿瘤增殖活性。 4.肿瘤特异性细胞毒性检测:在皮下注射PC-3细胞造模后的第21天，每组取一只小鼠，取出脾脏，分离脾细胞，先让脾细胞与丝裂霉素处理的PC-3作用致敏，之后，丝裂霉素处理过的PC-3铺板，加入不同细胞倍数的脾细胞作用4个小时，CCK8检测细胞活力，计算小鼠脾细胞的肿瘤特异性细胞毒性。 5.检测疫苗等是否对小鼠有副作用:观察期期间，检测小鼠血清中ALT、AST含量，监测小鼠是否发生GVHD。观察期结束后，对小鼠的重要脏器做HE染色进行组织学检查。 结果: 1.SA-hGM-CSF和SA-hTNFα重组蛋白具有很强的生物活性;锚定疫苗后蛋白依旧具有生物活性;经流式细胞术检测，锚定率达到要求。 2.小鼠腹腔注射hPBMC4周后血液中依旧检测到了hCD4+T细胞和hCD8+T细胞，小鼠脾、淋巴结hCD4+和hCD8+免疫组化显示，小鼠脾、淋巴结均有hCD4+T细胞和hCD8+T细胞浸润，结果说明成功建立了嵌合体小鼠。检测小鼠血清中ALT、AST的含量，并没有异常升高;小鼠精神状态无异常;无皮疹等说明未发生移植物抗宿主病。小鼠主要脏器的HE染色观察无异常，说明肿瘤疫苗并未造成明显毒副作用。 3.SA-hTNFα/hGM-CSF双重锚定修饰的LNCaP前列腺癌治疗性疫苗组和SA-hTNFα/hGM-CSF双重锚定修饰的PC-3前列腺癌治疗性疫苗组小鼠都有4只存活(4/4)，而PBS组只有1只小鼠存活(1/4)。疫苗组与PBS组有明显统计学差异(P＜0.05)。小鼠肿瘤中，两疫苗组hCD4+T细胞和hCD8+T细胞浸润程度明显高于PBS组;免疫组化Ki67染色结果表明，PBS组肿瘤增殖活性明显高于两疫苗组。 结论: 本实验成功建立了hu-PBL-NOD/SCID小鼠模型，并未发生移植物宿主病;实验结果表明SA-hTNFα/hGM-CSF双重锚定的LNCaP前列腺癌治疗性疫苗也能显著抑制PC-3肿瘤增长，增强T淋巴细胞浸润，延长荷瘤小鼠生存期，并对小鼠无毒副作用。这说明，以LNCaP为抗原的前列腺癌治疗性疫苗可以应用于前列腺癌的全程治疗，与GVAX(R)前列腺癌疫苗需要准备两种细胞系相比，大大地减少了疫苗制作的时间和成本，并使疫苗批次间更稳定。