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目的:肿瘤是目前严重危害人类健康的疾病之一,癌症更是威胁生命的杀手。天然产物来源丰富,具有多种生物活性,是药物发现的宝库。为了针对肿瘤治疗密切相关的靶点蛋白开发抗肿瘤药物,本研究选择热激蛋白HSPA8（Heat shock70 k Da protein 8,HSPA8）、细胞程序性死亡-配体1（Programmed cell death 1 ligand1,PD-L1）和钙敏感受体（Calcium sensing receptor,Ca SR）为靶蛋白,从中草药单体化合物库、藤黄属植物提取分离得到的化合物库、FDA药物库及临床和临床前药物库中筛选具有潜在靶向此目的蛋白的抗肿瘤活性成分,并阐述其抗肿瘤的作用。此外,发现以PD-L1和Ca SR为靶点的纳米抗体,为癌症治疗寻找新型抑制剂提供支持。方法:1.设计靶点蛋白的重组质粒,利用体外重组,借助大肠杆菌表达系统、昆虫细胞表达系统和哺乳细胞表达系统,表达并纯化靶点蛋白。2.运用质谱的方法检测蛋白的总分子量,并用Size Exclusion Chromatography-combined with multiangle light scattering（SEC-MALS）的方法分析蛋白的均一性。3.利用靶点蛋白制备CM5生物芯片,用表面等离子共振技术（Surface Plasmon Resonance,SPR）对化合物库进行初步筛选和复筛验证。4.用SPR和等温量热滴定法（Isothermal Titration Calorimetry,ITC）对筛选到的化合物进行亲和力测定,进一步验证其直接相互作用。5.利用分子对接软件,模拟筛选到的化合物Oblongifolin C（OC）与靶点蛋白HSPA8的结合模式,及其结合氢键的供体和受体。6.利用CCK-8法检测化合物OC对肿瘤细胞的抑制作用,利用流式细胞术检测化合物诱导细胞凋亡的作用。7.用小干扰RNA敲低或质粒过表达HSPA8目的基因后,测试化合物对细胞凋亡的影响。8.以Bac Mam表达系统纯化得到的PD-L1和Ca SR胞外区蛋白为抗原,免疫骆驼,利用噬菌体展示技术和ELISA技术筛选纳米抗体,并用SPR方法对表达纯化的纳米抗体进行验证。9.建立一种基于靶点蛋白生物芯片的高通量筛选方法。结果:1.利用体外重组蛋白的方法,得到高质量有活性的靶点蛋白。用质谱确定蛋白的总分子量与理论分子量一致,保证蛋白没有突变及降解,并用SECMALS的方法确定蛋白的单一状态。2.利用高质量蛋白成功制备CM5生物芯片,采用表面等离子共振技术（SPR）筛选到靶向HSPA8蛋白的小分子化合物Oblongifolin C（OC）,3.用SPR和ITC的方法测得OC与靶点蛋白HSPA8的亲和力,SPR测得其亲和力为8.9μM。ITC结果显示OC滴定HSPA8蛋白的亲和力6.2μM,滴定的吉普斯自由能△G为-7.11 kcal/mol,SPR和ITC结果都证明OC能够直接结合HSPA8蛋白。4.分子对接模拟结果显示,OC结合在HSPA8的ATP结合域,其主要结合方式为氢键和疏水作用,OC能够与蛋白Ser362形成氢键。5.细胞增殖实验显示OC对肿瘤细胞有抑制作用,双染结合流式细胞术实验显示OC能够诱导细胞凋亡。6.当敲低HSPA8基因后,OC诱导A549细胞凋亡的能力增加,而在过表达HSPA8基因的细胞株中,OC诱导的细胞凋亡的能力被逆转。说明OC通过靶点蛋白HSPA8发挥抗肿瘤作用。7.OC与顺铂联合用药比单独用药能够显著提高细胞凋亡率。8.利用体外重组,采用变复性的方法纯化得到高质量的PD-L1胞外区蛋白,筛选到靶向PD-L1胞外区蛋白的小分子化合物11个,其中Hydroferulic Acid（阿魏酸）和Chlorogenic Acid（绿原酸）是天然产物,具有抗肿瘤的作用。同时筛选到4个纳米抗体可以阻滞PD-L1与PD-1的结合。9.在4260个小分子化合物中筛选得到与Ca SR蛋白潜在结合的小分子化合物83个,其中天然产物占比23%。筛选得到12个高亲和力的纳米抗体,其中有3个纳米抗体对Ca SR有抑制作用。结论:本研究发现藤黄属植物提取分离得到的化合物OC通过靶向蛋白HSPA8发挥抗肿瘤活性,OC是一类PPAP类化合物,生物物理方法（SPR,ITC）显示其能够直接与HSPA8蛋白结合,有较高的亲和力。OC能够有效抑制肿瘤细胞的增殖并诱导细胞凋亡,与顺铂联合用药能够显著提高细胞凋亡率,利用基因沉默和过表达技术验证了OC通过靶向HSPA8发挥抗肿瘤作用。此外,本研究以PDL1和Ca SR为靶点,对4260个小分子化合物进行筛选,得到靶向PD-L1的化合物11个,潜在与Ca SR结合的化合物83个。此外还发现4个纳米抗体可以阻滞PD-L1和PD-1的结合,3个纳米抗体对Ca SR有抑制作用。并在此过程中成功建立一种基于靶点蛋白生物芯片的高通量筛选化合物方法。