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谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)是放线菌目棒状杆菌属高GC含量的革兰氏阳性细菌,在氨基酸工业生产中具有广泛应用。目前,代谢工程育种正在成为谷氨酸棒状杆菌氨基酸生产菌育种的主要手段,迫切需要开发各种表达载体和敲除载体。本研究主要是开发各种适用于谷氨酸棒状杆菌的敲除系统。主要研究结果如下:(1)针对果聚糖蔗糖酶编码基因sacB,构建了含有不同启动子的sacB表达质粒,并测定比较了它们在谷氨酸棒状杆菌中的果聚糖蔗糖酶活性。实验证明,枯草芽孢杆菌sacB基因自身的启动子不能在谷氨酸棒状杆菌中有效表达sacB;PlacM启动子能够有效表达sacB基因,赋予谷氨酸棒状杆菌蔗糖敏感性。通过测定果聚糖蔗糖酶活性,发现在谷氨酸棒状杆菌中,PlacM启动子效率比sacB基因野生型启动子效率提高18倍左右。(2)利用基于sacB的整合型载体pDXW-3成功敲除了C. glutamicum ATCC 13032的aceE基因。比较发现,pDXW-3载体比现在常用的pK18mobsacB/pK19mobsacB载体更加适合谷氨酸棒状杆菌染色体基因敲除。(3)构建了基于同源重组-特异位点重组的谷氨酸棒状杆菌基因敲除系统。该系统包括一系列载体,如pDTW109、pDTW201和pDTW202等。pDTW109质粒含有大肠杆菌复制起点oriE、温敏的棒状杆菌复制子rep (TS)、PtacM启动子启动下的氯霉素抗性基因cat和重组酶编码基因cre。pDTW109可以在Escherichia coli-C. glutamicum中穿梭复制、表达Cre重组酶和通过提高温度培养来去除。pDTW201和pDTW202分别含有两侧连接loxP、loxPLE/loxPRE重组位点的kan盒,可以作为模板扩增kan盒片段。(4)利用基于同源重组-特异位点重组的敲除系统敲除了C. glutamicum ATCC 14067染色体上的aceE基因,构建了菌株YTW-101。YTW-101胞内丙酮酸积累,可以作为构建以丙酮酸作为底物的氨基酸生产菌的出发菌株。进一步敲除了YTW-101染色体上的ilvA基因,构建了菌株YTW-102。YTW-102胞内不仅丙酮酸积累而且苏氨酸至2-酮丁酸的合成被阻断,因此可以作为构建L-缬氨酸或L-亮氨酸生产菌的出发菌株。