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MicroRNA(miRNA)是一类内源性非编码小分子RNA,对基因的表达以及各种生命体活动有重要的调控作用。研究表明,人类的许多疾病包括癌症都与miRNA的异常表达有密切关系。MiRNA已经作为一种新的生物标志物用于癌症等重大疾病的早期诊断。但是,miRNA序列短,在体内含量低,且许多同源序列仅仅有1~2个碱基的差别,相似程度很高,这就给miRNA的检测带来了挑战。所以,人们一直热衷于高灵敏的miRNA检测方法的研究。但是,在追求高灵敏度的同时,方法的简便、低成本,在方法的实际应用中同样重要。所以,如何建立简单、灵敏的miRNA检测方法,对于相关疾病的临床诊断,以及以miRNA为靶标分子的药物研究都具有重要意义。双链特异性核酸酶信号扩增(duplex-specific nuclease signal amplification,DSNSA)是一种由双链特异性核酸酶(duplex-specific nuclease,DSN)诱导的恒温核酸扩增技术。DSN能够特异性识别并降解RNA-DNA杂合双链中的DNA链,RNA链被释放,释放的RNA链可以继续参加下一轮的杂交-酶降解过程,如此循环,达到信号扩增的目的。纳米材料以其尺寸小、比表面积大、生物相容性好等优点被广泛应用于生物传感领域。本论文研究的目的就是想利用目标miRNA启动DSNSA反应,与金属纳米传感器结合,建立简单、灵敏的检测miRNA的新方法。具体内容如下:一、基于双链特异性核酸酶诱导的信号扩增结合金纳米粒子比色检测miRNA。单链DNA可以吸附在金纳米粒子(gold nanoparticles,AuNPs)表面,阻止盐引起的AuNPs的聚集。分散状态的AuNPs呈现明亮的红色,聚集状态的AuNPs会变蓝。有趣的是,我们发现短链DNA序列比长链DNA保护AuNPs的效果更好。基于此现象,结合DSNSA反应,我们设计了一种简单、灵敏的比色检测miRNA的新方法。首先,设计一条与目标miRNA序列完全互补的DNA探针,体系中存在目标miRNA时,DNA探针与miRNA杂交形成杂合双链。在DSN作用下,双链杂合体中的DNA探针被水解成短链DNA片段,miRNA被释放参与新一轮的杂交-水解-释放过程,如此循环,直到溶液中所有的DNA探针被水解,得到大量的短链DNA片段。由于短链DNA比长链DNA能够更好的保护AuNPs,阻止盐引起的聚集,所以,目标miRNA存在时,AuNPs不发生聚集,反应溶液呈现红色;反之,如果没有miRNA,DSN不能水解单链状态的DNA探针,溶液中的DNA探针不能稳定AuNPs,在盐的作用下,AuNPs发生聚集溶液由红色变成蓝色。该方法肉眼可区分低至10 fmol的目标miRNA。该方法过程简单,无需任何标记,利用DSNSA和AuNPs实现了恒温条件下,miRNA的可视化、灵敏检测。二、基于双链特异性核酸酶诱导的信号扩增结合银纳米簇荧光检测miRNA。银纳米簇(silver nanoclusters,AgNCs)具有较强的荧光性质,基于AgNCs和DSNSA反应,我们建立了一种简单灵敏的荧光检测miRNA的新方法。设计两条DNA探针,DNA探针I的5’端与目标mi RNA序列互补,3’端是富含G的序列;DNA探针Ⅱ的5’端是富C序列,能够形成暗的AgNCs,3’端是与目标mi RNA相同的DNA序列。首先我们利用DNA探针Ⅱ合成荧光很弱的AgNCs备用;当目标miRNA不存在时,DSN无法水解单链状态的DNA探针I,加入AgNCs,DNA探针I的5’端与AgNCs中DNA探针Ⅱ的3’端互补杂交,导致DNA探针I的3’端的富含G序列与形成的AgNCs靠近,增强AgNCs的荧光;反之,当目标miRNA存在时,miRNA与DNA探针I的5’端互补杂交,形成杂合双链,DSN能够水解双链中的DNA序列,所以,形成双链的DNA探针I的5’端被水解,3’端的富G序列和目标miRNA被释放,被释放的miRNA又与溶液中过量的DNA探针I杂交,开始新一轮的杂交-水解-释放过程,如此循环,直到所有的DNA探针I的5’端序列被水解。释放出的DNA探针I的3’端的富G序列无法通过杂交与AgNCs靠近,因此无法增强AgNCs荧光。该方法对目标miRNA的检出限可达0.08fmol(0.8 pmol/L)。该方法以AgNCs为纳米传感器,结合DSNSA反应,实现了miRNA的高灵敏度检测,为检测miRNA提供了新的平台。