动物胚胎干细胞（embryonic stem cells，ESCs）为早期胚胎发育、动物克隆、基因打靶和再生医学的研究提供了种子细胞。然而，由于取材困难和培养难度大等因素，大动物ES细胞的研究一直面临着很多困难。通过导入多能性转录因子，可以将体细胞重编程为诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cells，iPSCs）。iPS细胞的出现避免了ES细胞带来的困难，从而成为一种可代替ES细胞的多能干细胞，因此，iPS细胞是多能性细胞研究的热点之一。为了满足不同的研究用途，近年来研究出了多种方法来产生iPS细胞，最早使用的是逆转录病毒载体来介导转录因子对受体细胞进行重编程。由于逆转录病毒整合到宿主基因组上，对进一步的研究带来了困难，因此，大量的不同介导载体相继产生。本研究在使用逆转录病毒载体系统的同时，分别又采用了质粒载体介导系统和克隆猪L-Myc基因的方法对细胞进行重编程，为降低细胞致瘤性奠定了基础。1．逆转录病毒载体介导方法诱导体细胞重编程及其鉴定本研究利用小鼠的四个多能性转录因子Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc，以逆转录病毒载体介导，诱导八眉猪胎儿成纤维细胞（porcine embryonic fibroblasts，PEF），在干细胞培养液的条件下，得到八眉猪诱导多能干细胞（porcine induced pluripotent stem cells，piPScells）。这些细胞具有ES细胞样形态，集落边缘整齐，细胞的核质比较大，AP染色结果呈阳性，核型显示与正常的PEF细胞具有相同条数的染色体。能在体外稳定地长期培养，并且克隆形态保持不变。这些细胞能够表达内源多能性因子OCT4、SOX2、TERT等基因，表达SSEA-4，不表达SSEA-1，TRA-1-60和TRA-1-81。在体外诱导分化实验中，iPS细胞能够形成类胚体，并且具有三胚层分化的能力，在诱导分化过程中，分别加入诱导剂VC和RA，结果显示加入RA后，分化能力会显著提高。2．质粒载体介导方法诱导体细胞重编程本研究通过两个启动子的独立启动，构建了带有绿色荧光标记的Oct4/Sox2共表达诱导质粒载体(pOct4/Sox2-EGFP)。通过限制性内切酶检测，说明质粒载体pOct4/Sox2-EGFP构建成功。EGFP标记基因的表达和Real-time PCR数据的分析显示，Sox2在HEK293FT细胞中能够表达，且在转染的0-48h中，表达量成上升趋势。通过对转染细胞用Oct4抗体进行免疫荧光检测和Real-time PCR分析，说明Oct4基因在HEK293FT细胞中表达，且在转染的0-48h中，表达量显著上升。进一步对转染细胞进行Real-time PCR分析和免疫印记检测，发现受体细胞中检测到了NANOG的表达，而未经处理的受体细胞检测不到NANOG的表达。这一结果说明，在成体细胞中Oct4和Sox2的共表达能够激活内源NANOG基因的表达。因此，本研究为下一步应用质粒载体诱导体细胞重编程为iPS细胞的研究奠定了工作基础。3．猪L-Myc基因在细胞重编程中的应用本研究克隆出一段1113bp大小的cDNA，编码364个氨基酸，理论分子量为40kDa。这段基因与小鼠和人的L-Myc进行生物信息学分析得出，这三段基因的同源性很高，并且它们的蛋白结构功能域大体相同，这些结果证明了克隆得到的这段序列即为猪L-MyccDNA。构建融合表达载体pEGFP/L-Myc-C1，通过载体转染和免疫印记检测结果说明克隆的猪L-Myc cDNA能够在蛋白水平表达。再将L-Myc装入逆转录病毒载体中，分别使用不同的转录因子诱导猪胎儿成纤维细胞（PEF），结果显示，诱导后细胞的形态发生变化及AP染色后显示转录因子Oct4、Sox2、Klf4、L-Myc（OSKL）诱导后的细胞阳性克隆率远多于Oct4、Sox2、Klf4（OSK）的阳性克隆率，说明猪L-Myc基因在细胞重编程中起到了作用，为以后利用猪L-Myc基因进行诱导猪iPS细胞奠定了基础。