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猪德尔塔冠状病毒(Porcine Deltacoronavirus,PDCoV)是近年来新发现的肠道致病性冠状病毒。仔猪感染PDCoV后出现呕吐、腹泻和脱水等症状,有较高的发病率和死亡率,是导致仔猪死亡的重要原因之一。目前,在多个国家和地区都检测到了 PDCoV,在国内多个省份也有该病毒的相关报道。鉴于PDCoV在猪群中的广泛流行性及潜在威胁,本研究建立了检测PDCoV抗体的间接ELISA方法和细胞免疫组化法,以及检测PDCoV抗原的双抗体夹心ELISA方法。1.检测PDCoV抗体的间接ELISA方法的建立本研究通过DNAStar Protean软件对PDCoV N蛋白氨基酸序列进行分析,选取抗原性较强的区段(265～342 aa),根据大肠杆菌密码子使用的偏嗜性进行优化设计并人工合成了对应的基因片段N-Opti。分别利用pET-32a和pGEX-6p-1表达系统进行原核表达,获得的两种融合蛋白分别带有His和GST标签,命名为PDCoV-N-His和PDCoV-N-GST,且均呈可溶性表达。Western Blot鉴定结果显示两个重组蛋白大小均与预期相符,分别约为31 kDa 和 36 kDa。利用Ni-NTA亲和层析介质和高亲和力GST纯化介质,分别纯化出两种重组蛋白作为包被抗原进行ELISA检测,经比较,以PDCoV-N-His作为包被抗原检测效果更好。最终以PDCoV-N-His作为包被抗原建立了检测PDCoV特异性抗体的间接ELISA方法。经测定,该方法具有良好的特异性且重复性良好,与猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)和猪轮状病毒(PRoV)特异性阳性血清无交叉反应,批内和批间重复性试验的变异系数均小于10%。应用该方法对20份己知阳性血清和20份阴性血清分别进行检测,结果显示阳性符合率为100%(20/20),阴性符合率为100%(20/20),表明方法的特异性良好,可以进一步用于PDCoV感染的快速诊断和流行病学调查。2.检测PDCoV抗体的细胞免疫组化法的建立根据完整PDCoV N基因序列设计引物,利用RT-PCR方法克隆N基因,进而构建表达N蛋白的慢病毒载体。以包装的慢病毒感染Vero细胞,通过4μg/mL的嗓呤霉素筛选,获得稳定表达N蛋白的重组细胞系Vero/PDCoV-N。经Western Blot鉴定,该细胞系能表达与预期大小相符的41 kDa的蛋白条带。应用该细胞系进一步建立了检测PDCoV特异性抗体的细胞免疫组化检测方法。应用该方法检测已知PDCoV阳性血清,显色后细胞质呈现特异性棕褐色,而作为对照的Vero细胞无任何颜色反应。该方法的建立为PDCoV感染的快速诊断和流行病学调查提供了另外一种有效的血清学检测方法。3.检测PDCoV抗原的双单抗夹心ELISA方法的建立本研究以PDCoV-N-His蛋白为免疫原,以PDCoV-N-GST蛋白为检测抗原,采用杂交瘤技术,经ELISA筛选获得了 6株能稳定分泌针对PDCoVN蛋白单抗的杂交瘤细胞株,分别命名为1A2、4C5、5C5、8C12、8E8、10A7。亚类鉴定结果显示,在6株单抗中,4株为IgGi亚型,2株为IgM亚型。对6株单抗的相对亲和力和抗原结合表位进行综合分析,选择1A2为捕获抗体,HRP偶联的5C5为检测抗体,建立了双抗体夹心ELISA方法。该方法的双对数回归拟合线线性相关系数大于0.99,通过回归方程确定定量分析PDCoVN蛋白的检测范围为80 ng/mL～1.3μg/mL。批间和批内重复性试验的变异系数均小于10%,表明方法具有良好的重复性和稳定性。本研究建立的双单抗夹心ELISA方法展示出对重组N蛋白的良好检测效果,有望以此为基础进一步开发出可用于临床PDCoV感染诊断的特异性抗原检测方法。