内生真菌(Endophytic fungi)是指一类在其某个生活时期或全部生活阶段以寄居的方式生长于健康植物的组织或器官内,不对宿主造成明显病害的真菌。内生真菌在植物组织内普遍存在,长久以来,与宿主植物相互共存和互相影响,可以产生与宿主植物相似或相伺的生物活性成分。目前,药用植物内生真菌己成为获取天然活性物质的新型资源。山茱萸(Cornus officinalis Sieb.et Zucc.)为山茱萸科(Cornaceae)山茱萸属(Cornus)的多年生落叶小乔木,主要分布在河南、浙江、陕西、山西、安徽、四川等地。山茱萸除去果核的干燥成熟果肉,是世界上三大名贵木本药材之一。现代医学表明,山茱萸具有免疫调节、抗菌、抗氧化、抗肿瘤以及强心等功能。现己被列入药食兼用的名单之中。由于山茱萸开花时期易遭受倒春寒等自然灾害的破坏以及人为砍烧、割枝的影响,加之近些年来生态环境的改变等,都对野生山茱萸药材资源造成一定的破坏,因此,对山茱萸内生真菌资源进行充分开发,寻找其与宿主植物相似或相同成分的活性代谢产物可以为保护及可持续开发利用野生山茱萸药材资源提供新思路。本文对药用植物山茱萸中的内生真菌进行了分离和纯化,筛选出了可产山茱萸活性成分马钱苷的内生真菌,以期为山茱萸替代资源的研究提供一定的参考。本文主要研究结果如下:(1)采用微生物常规分离培养法,从无病害的山茱萸植物组织中共分离培养出27株内生真菌:茎8株、叶6株、花3株、果实10株。菌株分别编号为:J1-J8,Y1-Y6,H1-H3,G1-G10。(2)采用滤纸片法,以枯草芽孢杆菌A99(Bacillus subtilis)、金黄色葡萄球菌 26003(Staphylococcusaureus)和大肠杆菌 A70(Escherichia coli)为指示菌,检测了 27株内生真菌发酵产物的抑菌活性。结果表明,有22株菌株至少对1种供试菌产生抑制活性,其中菌株G3、G5和G9表现出较强的抑菌活性。(3)TLC结果显示,菌株G9的菌丝提取物与马钱苷标品具有相同Rf值,并且出现了颜色相同的斑点;HPLC复检结果表明,菌株G9的胞内产物与马钱苷标品的保留时间一致;HPLC-MS检测结果显示,菌株G9产生的离子碎片峰与马钱苷标品的分子离子峰一致,说明菌株G9能够产生与宿主相同的活性成分马钱苷。(4)根据菌株G9的菌落形态以及显微特征结合ITS序列分析,将菌株G9初步鉴定为水葫芦链格孢菌Alternariaeichhorniae。(5)为提高菌株G9马钱苷含量,对目标菌株G9的培养基及培养条件进行了优化。通过菌株在几种常用培养基中菌丝体生长和马钱苷产生情况的比较,菌株G9的最佳基础培养基是豆芽汁培养基;单因素分析对培养基成分优化确定菌株G9的最适C源和N源为葡萄糖和酵母膏;由菌株G9发酵条件正交优化得知,其菌丝体生长和马钱苷积累最佳培养方式为:豆芽汁培养基为基础培养基,葡萄糖6%,酵母膏0.30%，PH值6.5。优化前后,菌株G9的菌丝干重增长了 35.19%,马钱苷含量提高了 21.57%。