水稻OsDCL1和OsDCL4基因的功能研究

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分子生物学的中心法则认为DNA编码遗传信息,蛋白质行使功能,而mRNA充当信使将遗传信息从DNA传递到蛋白。目前,大量真核生物基因组测序结果发现,携带合成蛋白质信息的DNA在总序列中占据很低的比例,而大部分序列并不编码蛋白,而是以非编码RNA的形式发挥其重要作用。如microRNA(miRNA)和shortinterfering RNA(siRNA)是在真核生物中存在的两类21nt-24nt长的非编码小分子RNA,它们在维持染色体结构、防御病毒及调控发育中起着重要作用。   小分子RNA的发现是生命科学领域的重大突破,对其产生、生物学功能及应用的研究成为当前热点。水稻作为重要的经济和模式植物,其小分子RNA是如何产生的、它们是如何调控发育的还知之甚少。我们在水稻中发现了六个可能参与小分子RNA代谢的DICER-LIKE(DCL)基因。为揭示水稻中这些DCL蛋白在不同种类小分子RNA产生过程中的作用,我们首先克隆了小分子RNA,鉴定了三个水稻中特异的miRNA,同时通过RNAi的方法分别获得了OsDCL1和OsDCL4特异敲除的转基因植株。OsDCL1 RNAi转基因植株表现叶片和根系发育异常以及分蘖数减少。分子检测发现在转基因植株中miRNA不能正常产生,表明OsDCL1负责产生的miRNA,并对水稻发育具有重要调控功能。   我们进一步获得了水稻osdcl4突变体,序列分析发现,该突变体在启动子、5UTR和第一个外显子处有1.4kb的缺失,推测该突变体为功能缺失突变体,我们命名它为osdcl4-1。该突变体的胚芽鞘、第一片叶、颖壳等表现出明显的远轴面化的表型,显示其侧生器官腹背极性发育异常。生化研究表明,OsDCL4负责产生21nt长的siRNA,遗传学证据进一步证实OsDCL4参与外源转基因相关的21nt siRNA和内源TAS3trans-acting siRNA(ta-siRNA)的产生。通过microarray的方法和生物信息学分析,我们发现四个ARF基因受到TAS3 ta-siRNA的负调控。对其中一个ARF基因的原位杂交结果表明,该基因在野生型水稻叶原基的远轴面特异表达,而在osdcl4-1突变体中,该ARF基因在叶原基近轴面出现异位表达。因此osdcl4-1突变体的侧生器官表现出的腹背极性异常可能是由于TAS3 ta-RNA不能产生从而失去了对ARF基因在叶原基近轴面的抑制作用造成的。拟南芥同源基因的突变体dcl4表现出叶片稍窄和幼苗期到成熟期转变加快等较弱表型,只有当ASYMMETRICLEAVES1(AS1)/AS2途径和TAS3ta-siRNA途径的基因同时功能丧失才表现出明显的侧生器官腹背极性发育的异常。而我们在水稻和他人在玉米中的研究表明TAS3ta-siRNA途径的单基因突变足以导致严重的侧生器官腹背极性发育的异常,表明由DCL4参与的TAS3ta-siRNA途径在单子叶植物比在双子叶植物的侧生器官腹背极性建立中具有更显著的发育调控功能。   此外,我们还发现了一个内源的、可以通过自身回折形成茎环二级结构的转录本,虽然其结构类似于miRNA前体,但却被OsDCL4识别并切割产生21nt的siRNA,该发现为miRNA基因是由反向重复序列进化而来的假说提供了有力的实验证据。
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