龋病是人类最常见的细菌感染性疾病之一,变异链球菌(Streptococcus mutans, S. mutans)是其主要的致病菌。变异链球菌作为牙菌斑的优势菌在菌斑的形成、发展和成熟过程中发挥重要作用。牙菌斑是龋病的始动因素,作为典型的细菌性生物膜,由链球菌属,放线菌属,乳杆菌属和其他菌属微生物细胞和细胞外多糖基质组成,各种细菌存在于细菌胞外多聚物基质包绕的立体三维结构中,相互黏附、附着、定植于牙表面及界面。变异链球菌产生的酶在糖代谢中起主导作用,产酸能力和耐酸性使之在菌斑酸化和釉质的脱矿中起作用。变异链球菌表面蛋白抗原PAc参与牙表面获得性膜的非选择性黏附,能够促进变异链球菌在牙面的定植和牙菌斑的形成,PAc在细菌对牙面的初始黏附中起重要作用,是致龋的重要毒力因子之一。变异链球菌另外一个重要毒力因子是GTFs,其葡聚糖结合区(glucan-binding domain,GLU)负责葡聚糖的合成。合成的葡聚糖介导了细菌和牙面之间的蔗糖依赖性黏附,作用是使得变异链球菌更加紧密地黏附于牙面,形成致密的牙菌斑。因此将PAc与GLU作为候选的抗原通过免疫学手段控制致病菌的感染,可以达到防治龋病的目的。本课题组成功构建了编码人细胞毒性T淋巴细胞的相关抗原4(cytotoxic T lymphocyte-associated antigen4, CTLA-4)的信号肽和胞外区基因,免疫球蛋白IgAl型的绞链区和CH2和CH3区基因片段,变异链球菌葡糖基转移酶葡聚糖结合区(GLU区)和表面蛋白抗原PAcA区和P区的靶向融合防龋DNA质粒pGJA-P,以FDA认可的PVAX1为载体构建新型的DNA疫苗pGJA-P/VAX,且证实可以有效激发唾液特异型IgA (secretory IgA,S-IgA)抗体的产生,龋齿积分结果也显示其确实存在明显的免疫防龋效果。本实验旨在证明pGJA-P/VAX1的免疫效果是否是因为其刺激唾液特异性IgA (secretory IgA, S-IgA)抗体的产生而影响了牙菌斑的形成,实验同时在大鼠体内外检测S-IgA对变异链球菌黏附力的影响机制。实验将靶向融合防龋DNA疫苗pGJA-P/VAX1免疫大鼠,观察诱导产生的特异型分泌型IgA(secretory IgA,S-IgA)抗体动力学；使用变异链球菌UA140::Φ(mutAp-mrfρ1)体外培养变异链球菌生物膜；使用特异型IgA(secretory IgA,S-IgA)抗体作用于不同时期的变异链球菌生物膜,激光共聚焦显微镜(confocal laser scanning microscope,CLSM)观察变异链球菌生物膜厚度的变化,CFU计数计算生物膜重悬细菌的数量以检测S-IgA抗体对变异链球菌的黏附能力的影响,同时探讨了S-IgA影响变异链球菌黏附能力的机制；实验还研究了DNA疫苗诱导产生的唾液分泌型IgA对变异链球菌在HA珠上的黏附的影响,得出唾液产生阻断变链黏附作用的最高稀释倍数；实验还同时在大鼠口腔内使用测量生物膜厚度,检测牙表面生物膜细菌量,扫描电镜观察生物膜细菌生长状态等多方面观察S-IgA对变异链球菌在动物体内牙面上黏附力的影响以及直观观察S-IgA在大鼠唾液中对变异链球菌生长状态的影响。本实验分为以下三个部分：第一部分：防龋DNA疫苗诱导产生唾液分泌型IgA对变异链球菌黏附力影响体外实验研究实验一靶向融合防龋DNA质粒pGJA-P/VAX1免疫原性和免疫效能的实验研究方法：20只6-8周龄雌性SD大鼠随机分为2组：靶向融合防龋DNA质粒pGJA-P/VAX1免疫组和空白载体pVAXl免疫组,将两种质粒分别与布比卡因(Bupivacaine)混旋,制备Bupivacaine-DNA复合体,经鼻粘膜滴注途径免疫SD大鼠,免疫前和免疫后每隔两周采取唾液至初免后16周,ELISA检测特异性IgA抗体的滴度水平。结果：经鼻粘膜滴注途径,pGJA-P/VAX1比PVAX1诱导了更高的唾液特异性IgA反应(p<0.01),且第10周达到高峰。结论：证实靶向融合防龋DNA质粒pGJA-P/VAX1可以有效诱导机体抗体反应。实验二体外变异链球菌生物膜模型的建立方法：使用UA140::Φ(mutAp-mrfρ1)体外培养变异链球菌生物膜。收集未免疫大鼠的空白唾液,60℃巴氏消毒30min,离心收集上清0.22μmm滤膜滤菌后备用。24孔板内置羟基磷灰石片,无菌唾液37℃摇床孵育4h形成获得性膜后去除唾液,每孔加BHI培养基,蔗糖,变异链球菌悬液厌氧共培养16h。细菌CFU计数使用振荡器上剧烈震荡2分钟的方法。取羟基磷灰石片,附着培养16h后生物膜的羟基磷灰石片,剧烈震荡后羟基磷灰石片各一片,常规处理扫描电镜观察。结果：HA片表面可以见到由规则六边形构成,最大程度模仿牙齿主要结构羟基磷灰石；16h后羟基磷灰石表面生物膜形成可以见到清晰的变异链球菌结构,变异链球菌在HA片表面均匀附着,形成生物膜结构,高倍镜下可以明显观察到链球菌的链状结构；振荡器剧烈震荡2min后表面存留变异链球菌很少,说明此重悬的方法能够有效去除HA表面附着的细菌,可以用于生物膜的后期重悬处理并用于细菌计数。结论：证实此方法可以用于本实验。实验三：S-IgA影响变异链球菌生物膜影响的机制的实验研究方法：使用不同的实验设计检测S-IgA减少变异链球菌生物膜形成的机制。Ⅰ组实验分别采用A组或B组唾液孵育4h在HA片上形成获得性膜后,然后加入正常未免疫大鼠培养生物膜,培养方法同前。实验结束,使用FITC标记的羊抗大鼠IgA标记获得性膜上的IgA,使用激光共聚焦显微镜观察获得性膜表面S-IgA的荧光强度是否有区别,并测量培养后的生物膜厚度和CFU计数,研究S-IgA是否对变异链球菌的初期定植产生影响；Ⅱ组实验采用正常唾液培养获得性膜后,加入A组或B组唾液与细菌共培养,观察对后期的黏附产生的影响。培养结束后取培养皿中剩余培养液,加入PBS稀释的FITC标记的羊抗大鼠IgAlml,使用PBS洗涤菌体数次,干净玻片涂片激光共聚焦显微镜观察S-IgA与变异链球菌是否存在结合情况;Ⅲ组实验常规培养变异链球菌生物膜16h后,在孔中加入A组或B组唾液,另设PBS对照组,37℃水浴孵育2h,观察S-IgA对成熟的生物膜是否产生影响。结果：使用A组唾液形成的获得性膜上面可以见S-IgA的附着且比B组明显增加,且形成生物膜厚度和CFU计数均与B组有显著性差异(P<0.01),A组形成获得性膜后在其上黏附的细菌厚度(少41.02%)和数量(少41.79)比B组形成的获得性膜要明显减少;直接使用两组唾液共培养,两组生物膜厚度和CFU存在显著性差异(P<0.01),A组形成的生物膜的厚度和黏附细菌数量分别比B组减少27.4%,22.81%,而且可以观察到S-IgA包裹在变异链球菌表而或是黏附在变异链球菌表面或同时产生作用；而对于牙菌斑生物膜已经形成,两组唾液对变异链球菌生物膜的厚度和CFU的影响无显著性差异(P>0.05);结论：S-IgA阻断变异链球菌生物膜的形成的机制在于可以参与形成获得性膜,对变异链球菌的初期黏附产生影响,且通过和变异链球菌表面成分相结合,促进变异链球菌的成团生长,影响其后期的定植,而对已经形成的生物膜没有明显作用。第二部分S-IgA对变异链球菌在羟基磷灰石珠上黏附力的影响研究实验四S-IgA对变异链球菌在羟基磷灰石珠上黏附力的影响结果方法：20只6-8周龄雌性SD大鼠随机分为2组：靶向融合防龋DNA质粒pGJA-P/VAX1免疫组和空白载体pVAX1免疫组,将两种质粒分别与布比卡因(Bupivacaine)混旋,制备Bupivacaine-DNA复合体,经鼻粘膜滴注途径免疫SD大鼠,免疫前和免疫后每隔两周采取唾液至初免后16周,ELISA检测特异性IgA抗体与唾液总IgA比值。取5mg羟基磷灰石检测分别与第4,10,16周大鼠唾液共培养1小时观察这几周唾液分别对变异链球菌的黏附力的影响。另外将第10周唾液分别稀释1：2；1：4；1：8；1：16；1：32后加入共培养1小时检测能发挥阻断作用的最大稀释倍数。培养结束后使用KCL洗涤三次,取洗涤后的悬浮菌液使用液体闪烁谱仪根据变异链球菌特性计算菌液中细菌量。其中使用对照组唾液和PBS作为对照组。结果：经鼻粘膜滴注途径,pGJA-P/VAX1比PVAX1诱导了更高的唾液特异性IgA反应(p<0.01),且第10周达到高峰;4w,10w,16w唾液处理后HA片上粘附的细菌量比对照组和PBS组都有明显减少(P<0.(01),且第十周唾液的阻断作用更加明显；10周唾液经过1：2；1：4；1：8；1：16稀释后与对照组和空白组相比均更多减少变异链球菌的黏附(P<0.01),且1：16是最高稀释倍数。结论：疫苗免疫后的大鼠唾液持续存在阻断变异链球菌在HA上的黏附且此黏附作用与唾液中S-IgA的量成正相关。第三部分防龋DNA疫苗诱导产生唾液分泌型IgA对变异链球菌黏附力影响的体内实验研究实验五S-IgA在大鼠口腔内对变异链球菌在牙而上黏附的影响方法：免疫后第九周开始一周内去除大鼠口腔内牙菌斑,最后一次清洁牙面4小时后断颈处死大鼠,无菌环境下取下带大鼠磨牙的下颌骨,体外使用Rhodamine标记的羊抗大鼠IGA二抗孵育(1：2500稀释于PBS中)2h后激光共聚焦显微镜观察表面S-IgA荧光强度的对比,观察S--IgA是否参与获得性膜的形成。之后两天无菌棉签定菌,48h后取大鼠唾液和上下颌磨牙：左上颌磨牙使用扫描电镜观察牙表面变异链球菌黏附细菌的量和形态的区别；左下颌的磨牙激光共聚焦显微镜观察牙表面变异链球菌黏附的量的比较；右上颌磨牙体外振荡表面黏附细菌后细菌计数；激光共聚焦显微镜观察唾液中S-IgA与变异链球菌相互作用的情况；并在定菌后持续取唾液样本检测唾液中UA140::Φ(mutAp-gfp1)总变链的比值。结果：实验组唾液比对照组唾液在牙表面形成获得性膜的荧光强度高,说明S-IgA参与获得性膜的形成；扫描电镜实验组牙表面变异链球菌比对照组细菌明显减少；实验组牙表面生物膜厚度和细菌量比对照组明显减少(P<0.01)；且在激光共聚焦显微镜下可见实验组唾液中的变异链球菌多成团生长,而对照组唾液中变异链球菌成散在分布,镜下可观察到S-IgA能够与变异链球菌紧密结合,包裹在细菌表面；实验期间实验组显著降低了定菌数口腔内UA140::Φ(mutAp-gfp1)占口腔变链的百分比(P<0.01),此趋势一直维持到实验结束。结论：防龋DNA疫苗诱导产生唾液分泌型IgA在体内也能明显减少变异链球菌对牙面的黏附,并能通过形成获得性膜和促进细菌的成团生长利于清除起到防龋的效果。