纤维素是自然界中存在最广泛的一类碳水化合物,同时它也是地球上数量最大的再生资源。目前,自然界中纤维素只有一小部分得到了利用,绝大多数纤维素不仅被白白浪费,而且还会造成环境污染。利用微生物生产的纤维素酶将其转化为人类急需的能源、食物和化工原料,对于人类社会解决环境污染、食物短缺和能源危机具有重大的现实意义。 纤维素酶(cellulase)能将天然纤维素降解生成纤维素分子链、纤维二糖和葡萄糖。目前,纤维素酶在水解纤维素在食品、饲料、酿造、化工、纺织、医药和环境保护等领域均有广泛应用。纤维素酶来源多样化,原生动物、节肢动物、软体动物和昆虫等均能产生,动物的瘤胃中有共生的纤维分解菌和原生动物。在高等植物中也有纤维素酶,目前用于生产纤维素酶大多采用微生物来源。 本课题采用绿色木霉13010和13002作为出发菌株,利用诱变因子的协同作用,对其进行了诱变育种,得到酶活力较高的突变菌株绿色木霉SP13010(Trichoderma viride),用于发酵并从发酵液中分离纯化纤维素酶,目的旨在得到高的回收率,通过硫酸铵分段盐析、离子交换层析、分子筛凝胶过滤层析等较简单的方法纯化得到有高活力的纤维素酶纯品。主要实验结果如下: 1.紫外线、亚硝酸钠和硫酸二乙酯三种不同的诱变因子对绿色木霉13010菌体细胞的致死作用表现出相似的趋势,在一定范围内都与诱变剂量呈线性正相关。利用紫外线、亚硝酸钠及硫酸二乙酯复合诱变的协同效应,研究其诱变时间、诱变剂量和正突变率的关系。在协同诱变条件下,多轮反复诱变绿色木霉13010后,菌株的酶活力有大幅提高,筛选得到了产纤维素酶活力单位提高了173.15%的菌株—SP13010。诱变因子的复合、协同诱变,可以减弱单一诱变剂反复诱变产生的诱变抗性和饱和性,是一种有效的选育优良菌株的方法。 2.确定了硫酸铵梯度盐析的浓度范围。在硫酸铵浓度为30%时,酶的活性极低,且杂蛋白含量较高。收集硫酸铵为30%～50%饱和度范围内的盐析酶蛋白,收集产物具有较高酶活性。继续收集50%到65%范围内的盐析酶蛋白,酶的比活仍然较高。收集65%～80%范围内的盐析酶蛋白,酶的比活较低。综合考虑酶的收率及酶的比活,采用30%～65%饱和度范围内的硫酸铵盐析。 3.探索并确定了DEAE-Sephadex A25离子交换层析的参数。结果表明,不同的平衡缓冲液pH值介质对酶蛋白的吸附有很大的影响,其中pH值为8.5时,吸附效果最好。初始洗脱的盐浓度对洗脱效果也有很大影响。采用试管实验简单快捷的确定了初始洗脱的盐浓度,节省了大量时间,实验表明,在初始盐浓度为0.1 mol/L时即可。 4.采用DEAE-SephadexA25离子交换层析纯化纤维素酶。采用的平衡缓冲液pH值为8.5,NaCl梯度线性化洗脱浓度为:0.10～0.50mol/L。洗脱后NaCl浓度在0.135mol/L至0.45mol/L时洗脱出多个蛋白峰。在NaCl浓度高于0.45mol/L时,基本没有蛋白洗出。洗脱流速为30mL/h,