荔枝PG和PME基因克隆以及与落果相关基因定量表达研究

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多年的形态学和解剖学研究结果显示植物器官脱落主要是离区细胞壁胞间层和初生壁发生降解,即果胶和纤维素的水解,细胞之间黏附力降低,从而在重力的作用下使器官与植物母体分离。在进一步研究后,人们发现多聚半乳糖醛酸酶(PG)和果胶甲酯酶(PME)主要参与植物果胶降解,而β—1,4—内切葡聚糖酶(EG)则是纤维素降解过程中关键酶之一。并且大量研究结果显示这些基因都参与了植物器官脱落,但在荔枝落果方面还没有相关基因表达水平上的研究。因此通过研究荔枝中PG基因家族和PME基因家族各成员在荔枝落果过程中的表达变化规律,来分析各个基因与荔枝落果之间的关系,为以后调控荔枝落果提供科学依据。主要研究结果如下: 本实验采用一套取样量少、提取效率高和速度快的改良RNA提取方法,即LSS法,以解决荔枝离层质量少的问题。通过验证该方法适合多酚、多糖含量高的植物,并且能从该类植物中提取出高质量的RNA。通过在RNA得率、操作繁琐性和费用等方面比较的结果显示该方法的综合评价优于热硼法。 分别在荔枝上首次克隆出了以下基因片段或全长。5个PG基因片段:Lc-Pg1(片段大小900bp)、Lc-Pg2(片段大小200bp)、Lc-Pg3(片段大小940bp)、Lc-Pg4(片段大小870bp)、Lc-Pg5(片段大小862bp);1个PME基因片段:Lc-Pme(片段大小960bp);1个3—磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)基因片段:Lc—gapdh(片段大小1200bp);1个肌动蛋白(Actin)基因全长:Lc—actin核苷酸序列大小为1786bp,其中5端非翻译区为152bp,3端非翻译区为482bp,推测其氨基酸序列含有378氨基酸。 建立了一套优化的荔枝细胞壁水解酶基因的荧光定量PCR体系。主要步骤包括RNA样品中DNA消化及相应的检测体系;基于Northen杂交探针引物设计原则的荧光定量PCR引物设计;利用普通PCR进行的引物对正确性的验证以及浓度的优化;内参基因的选定以及每个基因的扩增效率和相对表达量的计算等。 田间试验表明,在花后30d外源喷施40mg/L乙烯利和10mg/L2,4—D对‘淮枝’荔枝幼果脱落的效应明显不同,表现为在处理后3~7d乙烯利处理的相对落果率明显高于对照,2.,4—D处理则明显低于对照,但是它们促进和抑制果实脱落的效果一般只能维持15d左右。 采用优化的荧光定量PCR技术对不同植物生长调节剂处理下‘淮枝’荔枝幼果及其离层中细胞壁水解酶的表达差异进行了分析。结果表明在果实和离层中检测到有表达的基因有Lc-Pg4、Lc-Pg5、Lc—eg1、Lc—eg12和Lc—eg14五个,没有表达的基因有Lc-Pg1、Lc-Pg3以及Lc-Pme三个;Lc-Pg4和Lc—eg12的表达情况与不同处理的落果之间没有联系,因此认为这个两个基因与荔枝幼果的脱落无关。Lc—eg1、Lc-Pg5和Lc—eg14这三个基因不同处理之间在果实中表达差异不大,但在离层中有较为明显的差异,其中Lc—eg1的表达之间的差异与不同处理之间落果差异最为相似,即在处理后3~7d乙烯利处理的Lc—eg1基因相对表达量明显高于对照,2,4—D处理则明显低于对照,但是在处理后15d则均与对照无明显差异,据此可以认为该基因可能是负责荔枝幼果脱落的关键基因之一;Lc-Pg5和Lc—eg14这两个基因经乙烯利处理后3d的相对表达量均非常明显大于对照,7d时Lc-Pg5的表达已恢复到对照水平,Lc—eg14还是高于对照,经2,4—D处理后的3~7d,这两个基因的表达量则是均表现为低于对照,但在处理后15d时又都高于对照,据此认为这两个基因与荔枝幼果脱落也可能有一定的关系。
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