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目的:疟原虫是疟疾的病原体,全球范围内的多种脊椎动物可能受到感染,包括鸟类、爬行动物、两栖动物和人类,传播如此广泛的病原体对人类的健康构成了巨大的威胁。开发有效的抗疟疾疫苗的主要障碍是对疟原虫复杂的生活史以及对疟疾感染的复杂免疫反应了解不足。根据寄生虫发育的阶段,疟疾疫苗可分为三类:红前期疫苗（Pre-erythrocytic vaccines,PEVs）,红内期疫苗（Blood stage vaccines,BSVs）和传播阻断疫苗（Transmission-blocking vaccines,TBVs）。TBVs不仅可以有效控制疟疾,还可以预防耐药寄生虫的出现和传播。发现新的TBVs靶点成为时下最关键的任务之一。TBVs通过影响蚊阶段的感染来阻断疟疾的传播。目前传播阻断效果较好的候选抗原包括配子体和配子表面抗原P48/45和P230以及合子和动合子表面抗原P25和P28。P48/45和P230敲除导致合子形成减少,P25和P28则影响动合子的存活和卵囊的发育,研究表明P25和P28缺失都会导致蚊子中肠几乎没有卵囊形成。由于不受人体免疫选择压力的影响,表达在雌雄配子受精后阶段的抗原可以产生较长的免疫力且变异较少。利用体外培养系统培养动合子、使用梯度密度离心法分离纯化培养后的动合子可极大程度上分离非动合子阶段疟原虫及RBC,得到的动合子纯度较高,可用于进一步的研究。转录组,指细胞某一时期所有基因的转录水平,转录组学是一门在整体水平上研究细胞中基因转录情况及转录调控规律的学科。简而言之,转录组学是从RNA水平研究基因表达的情况。对疟原虫合子到动合子阶段的转录组的研究和比较可以揭示在这一阶段基因的转录水平,从而揭示特定基因的作用机制或其相关功能。因此,本研究拟通过分析伯氏疟原虫雌雄配子结合后继续培养2h、6h、12h、24h的转录组,鉴定这一阶段的转录特征来推断和发现潜在的TBVs候选基因。研究方法:1)野生型伯氏疟原虫动合子培养及纯化。20只6～8周龄的雌性KM小鼠平均分成4组,每组每只小鼠经腹腔注射0.06mg/ml的苯肼,3d后经尾静脉注射5×106个野生型伯氏疟原虫（Plasmodium berghei）感染的RBC（infected red blood cell,iRBC）,待原虫血症达10%左右取眼球血,4组眼球血分别置于动合子培养基中在19℃环境下培养2h、6h、12h和24h,培养物经涂片染色鉴定培养效果。使用62%Nycodenz溶液纯化疟原虫,用0.2%红细胞裂解液裂解红细胞,裂解后的产物经PBS洗涤两次。2)转录组学实验。使用洗涤后2h、6h、12h、24h样本提取Total RNA样品,适温变性打开其二级结构,使用oligo（d T）磁珠分别富集4组mRNA,加入打断试剂将mRNA片段化,使用PCR仪合成一链cDNA,继续合成二链cDNA。适温反应,修复双链cDNA末端,并在3’末端加上A碱基,配制接头连接反应体系,将接头连接至cDNA。将PCR产物变性为单链后适温反应得到单链环形产物,消化掉未被环化的线性DNA分子后,即得到最终的文库。使用Agilent 2100Bioanalyzer检测文库的片段大小及浓度。通过联合探针锚定聚合技术进行测序,得到50bp/100bp/150bp的测序读长。3)转录组学的生物信息学分析。筛选雌雄配子结合后培养2h、6h、12h、24h差异表达的基因。对表达量经过log2转换,采用MEV进行聚类分析,选取2h、6h、12h、24h表达量持续上调的一组Cluster,以热图展现表达差异,同时对这组Cluster进行GO功能分类,选择2h、6h、12h、24h表达量持续上调且在膜上表达的1个基因进行综合分析。4)qRT-PCR实验验证转录组数据。提取雌雄配子结合后培养2h、6h、12h、24h的四组RNA,反转录成cDNA备用。选择基因PBANKA＿1241500设计qRT-PCR引物,以β-tubulin为内参进行qRT-PCR实验。产物经琼脂糖凝胶电泳及Tanon扫胶仪进行可视化,使用Image J进行定量分析。5)基因加HA标签型虫株的构建。使用双交叉同源重组法给基因C端加HA标签,加标签质粒电转染至成熟野生型伯氏疟原虫裂殖体内,并通过尾静脉将转染后的裂殖体注射给小鼠。带有耐药基因的加标签型虫株通过小鼠饮用乙胺嘧啶进行阳性筛选,提取疟原虫基因组,PCR鉴定电转是否成功。电转成功后进行极限稀释法单克隆化筛选,PCR鉴定单克隆结果。6)候选基因的蛋白定位。间接免疫荧光实验（Indirect immunofluorescence assay,IFA）检测蛋白表达阶段及表达部位,免疫印迹实验（Western blotting,WB）验证蛋白的表达情况。结果:1)转录组学GO功能分类。转录组学生信分析表明,在雌雄配子结合后培养2h、6h、12h、24h,表达量持续上调的基因可检测到193个,GO功能分类显示在生物过程（Biological process,BP）这一大类中包括有机氮化合物代谢过程、生物合成的过程、细胞生物合成的过程等,其中有机氮化合物代谢过程占比最高,占比8.8%;细胞组分（Cellular component,CC）可分为膜片段、膜的本征成分、胞质部分等,其中膜片段占比最高,达27.8%;分子功能（Molecular function,MF）可分为结合、杂环化合物结合和催化活性等功能,其中结合功能催化活性占比最高,分别占比10.0%,杂环化合物结合功能次之,占比8%。2)qRT-PCR验证转录组学数据。根据下载自Plasmo DB的PBANKA＿1241500序列设计qRT-PCR引物,qRT-PCR结果表明PBANKA＿1241500表达量在2h、6h、12h、24h持续上调,即与转录组结果一致。3)候选基因蛋白表达阶段预测。IFA和WB结果表明PBANKA＿1241500在2h、6h、12h、24h都有表达,IFA结果表明该基因表达在膜上,在动合子阶段,于动合子基底部有明显高表达。结论:1)PBANKA＿1241500在疟原虫种属中保守性较好,在动合子基底部有高表达;2)结合疟原虫数据库对动合子转录组学数据进行筛选,可以为发现传播阻断疫苗候选基因提供依据。