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目 的 （1）观察不同浓度的紫杉醇对食管癌细胞Eca109生长的影响； （2）研究紫杉醇能否阻滞细胞周期及诱导细胞凋亡，并在此基础之上探讨两者之间的关系； （3）通过测定bcl-2、p53、p21WAF1/CIP1在紫杉醇处理前后的变化，探讨紫杉醇治疗食管癌的分子机制。方 法 （1）细胞与细胞培养 人食管癌细胞株Eca109来自北京肿瘤防治研究所，用含10％小牛血清的RPMI1640培养液培养，生长于37℃含5％的CO2孵箱中，待细胞长至单层后，以0.25％的胰蛋白酶消化贴壁细胞，选用对数生长期细胞用于实验。 （2）细胞增殖抑制实验 采用MTT法，选择对数生长期细胞，调整细胞数为2.5×104/ml接种于96孔培养板，每孔200μl，24h后，实验组分别给予终浓度为0，20，40，80，100nmo1/L泰素，同时设立对照。每组的每个浓度设3个复孔，12h、24h、48h后，每孔加入20μl 5mg/ml MTT，孵育4h后弃上清，加入DMSO终止反应。微振荡后，于酶标仪波长570nm处测吸光度（A）。计算抑制率（％）=（1-实验组 A/对照组 A）×100％。由此得出的半数抑制浓度(IC50)作为确定紫杉醇体外实验浓度的依据。 南京医科大学硕士学位论文 门)形态学观察 细胞经不同搬的紫杉醇作用后定时用形罪海 化收集，细胞离。c涂片，乙醇室温固定，Giemsa染色，光彩汐见察．收集的细胞同时按常规进行透射电镜观察、摄片。 N)细胞周期和细胞凋亡率的测定 收集不同贩药物作用的 Eca109细胞，PBS洗躯用 4C的 7ds乙醇固定 12h以上，经离。r去乙醇，加 1％Rnase200 111，37℃水浴 15 r，加 PI染色，用Beet皿 Dickins。公司跳 ChlibUr 型流式细d（抓敝光波长为 48812ill），IRI％ DNA ％f测定兰胞日相（ Gf1，S，GN），位于 Gk前期的亚二倍体峰为‘碉亡峰”，所得酬均经 Lysis＊车大f牛 集、贮存和掀。 u)bCIQ、p53、PZI””‘蛋白在紫杉醇处理椭的表达变化朋免喇删u，另比12加用流式细BI。结 果 门)紫杉醇对细胞生长的影响 不同浓度紫杉醇与Eca109细腆同孵育后，细胞生长受到抑制，并呈剂量酮关系，其妨＊时＊ 为151：lllDI 儿。 K)细月眺态学变化正常情况下；Eca109细雕多角形，贴壁生长。在紫杉酬用下，癌细hsi＆A)t变圆，折光姓减弱，贴壁细BS，．．Mv，少。5删VI 紫杉醇处埋的细胞撇下E小时可贼大小不均，而ltonllnl八紫杉醇处理的细咖台终大小均匀。电镜下经紫杉醇处理的细腑出现细B咙伽固缩、解聚以及凋亡小体；并可见牌处于分驯彬田胞，而对照组细胞生长盼，枫上述改变。 门)细舶期及脱脓 无删氏搬的紫杉醇，跟高浓度的紫杉醇均可将 kal阴刎包阻滞于GN期。寸搬（5删V 1）紫杉醇处理的细胞阻断GN期短暂、不完全；而高浓度（15mVI、二）白紫杉酬树癌细胞白“肋期阻断较低搬的完全、持久，24小时达高峰，且搬愈高梆作用尤为明显。在Gy期阻断作用过去后，流式细胞仪可检测到凋亡峰， 2 南京医科大学硕士学位论文snllDI八的紫杉醇由于其较早越过GW期，12。J、时便可检钡到凋亡峰，15TlllDI八、35nllDI八的紫杉躲药物作用后48，1、时才 倒凋亡峰。 忖)be12、P53、咋l—一‘蛋白的表达变｛b be12、P53蛋白在紫杉醇处理前后无变化；P21”一蛋白在紫杉醇作用后表辅力口。结 论 门)紫杉眺体外肺抑制人食管癌细胞株Eca109增殖的作用，这种作用与剂量、时间呈州B关。 K)紫杉醇不lxM－－arxgude管癌细胞阻滞于 GN期，还啸导其凋亡。姚搬的紫杉贼高搬的更易赃刎 包凋亡，对临床紫杉醇治疗剂量的制定具有一定的树峋。 （3）在ra109细脓中，kIQ、p53蛋白的表滩紫杉醇处理椭并无改变；提示bCI亿、P53可能并不参与紫杉醇腑食管癌细胞凋亡的腑；研究中梆扯1——‘的表达在紫杉郧用后增加，献阅…’有可能参与紫杉醇阻滞细3响期及诱导细胞凋亡，贿关确切栅0仍有敝一步腑。