生物可降解Mg-1Zn-1Sn-xSr合金的设计制备、生物相容性及生物学性能研究

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第一部分Mg-1Zn-1Sn-xSr合金的制备、表征检测以及抗腐蚀性能评估目的:选择具有良好生物安全性和生物可吸收性的三种人体必须营养元素Zn、Sn和Sr作为合金化元素,并采用低合金化、热挤压的加工方式制备了四种Mg-1Zn-1Sn-xSr(x=0、0.2、0.4、0.6 wt.%)合金,并检测其微观结构、力学性能及抗腐蚀性能,为后续研究提供理论基础。方法:利用ICP-OES检测所制备的镁合金实际元素化学成分组成;采用金相显微镜和SEM观察合金的微观结构,通过XRD和XPS分析和鉴定合金的相组成和合金表面化学成分;采用压缩试验和拉伸试验评估合金的力学性能;通过电化学测试和浸泡实验了解合金的抗腐蚀性能。结果:Mg-1Zn-1Sn-xSr(x=0、0.2、0.4、0.6 wt.%)合金的各实际元素化学组成与实验设计基本一致,其中Sr的含量分别为0 wt.%、0.16wt.%、0.38 wt.%和0.51 wt.%;铸态Mg-1Zn-1Sn-xSr呈典型的枝晶结构,随着Sr含量的不断增加,晶粒细化显著,第二相逐渐增多且分布不均,经热挤压后,晶粒尺寸约为20μm左右,第二相均匀分布于合金中,合金主要由α-Mg相和少量Mg Zn和Mg17Sr2第二相组成。随着Sr含量的增多,挤压态Mg-1Zn-1Sn-xSr(x=0、0.2、0.4和0.6 wt.%)合金的力学性能逐渐增强,极限抗压强度为404447 MPa;屈服强度为82126 MPa;压缩应变为17.021.1%。极限抗拉强度为229268MPa,屈服强度为151178 MPa,断后延伸率为8.09.0%。电化学测试和浸泡实验结果表明随着Sr含量的增加,合金的抗腐蚀性能呈现出先增强后减弱的趋势,其中,以0.2Sr合金的抗腐蚀性能最强,通过电化学测试结果和浸泡失重结果推算出的腐蚀率分别为0.16 mm/y和0.55 mm/y。结论:成功制备了挤压态Mg-1Zn-1Sn-xSr(x=0、0.2、0.4和0.6wt.%)合金,合金主要由α-Mg相和少量Mg Zn和Mg17Sr2第二相组成,合金中的第二相数量和分布可能是引起合金各方面性能差异的重要原因。该合金体系的力学性能均能较好的满足作为骨科内植物的需求,且随着Sr含量的增高,力学性能逐渐增强。0.2Sr合金具有最好的抗腐蚀性能,较好的满足了作为骨科内植物材料的基本要求,在生物医用领域有巨大的发展潜力和研究价值。第二部分挤压态Mg-1Zn-1Sn-xSr合金的体外生物相容性和生物活性研究目的:探究挤压态Mg-1Zn-1Sn-xSr(x=0、0.2、0.4和0.6 wt.%)合金的体外生物相容性,对成骨细胞的增殖、粘附、迁移、周期等生物行为学的影响及其可能原因,评估各合金在体外诱导成骨分化的能力,为后续体内实验研究提供理论支持。方法:通过死活染色、凋亡检测、CCK-8和周期检测评估合金浸提液对细胞毒性和细胞增殖活力的影响;通过划痕实验观察合金浸提液对细胞迁移的影响;采用CLSM观察浸提液中细胞的粘附面积和粘附密度;通过CLSM和SEM观察细胞在材料表面的粘附、扩展和增殖情况,p H计记录培养基的p H值,ICP-OES检测共培养过程中,培养基中各金属离子浓度,并在光镜下观察合金的产氢情况;通过ALP染色与活性检测,ARS染色,COL-Ⅰ免疫荧光染色和q RT-PCR系统地研究了各合金对细胞成骨分化的影响。结果:死活染色、凋亡检测以及CCK-8结果表明,Mg-1Zn-1Sn-xSr合金浸提液具有良好的生物相容性,并具有较显著的促细胞增殖作用;周期检测结果表明,与对照组相比,0.2Sr合金组中处于S相的细胞比例显著增加(P<0.05);无论是通过浸提液培养还是与材料共培养,0.2Sr合金均具有最佳的促细胞增殖、粘附和扩展的能力,光镜下观察发现Mg-1Zn-1Sn-xSr合金与细胞共培养过程中的产氢量显著低于p-Mg,同时SEM还发现共培养过程中0.2Sr、0.4Sr和0.6Sr合金表面可自发形成一层具有微纳米形貌的网状结构,这可能有利于细胞在合金表面的粘附、扩展和增殖;ALP染色及活性检测、ARS染色以及COL-Ⅰ免疫荧光染色结果均表明0.2Sr、0.4Sr和0.6Sr组的成骨诱导活性显著高于PC、p-Mg和0Sr组(P<0.05),能够较强的刺激ALP的表达、钙化结节的沉积以及COL-Ⅰ的分泌,其中以0.6Sr合金的骨效果最为明显,合金的促成骨效应存在明显的Sr含量剂量依耐性;此外,成骨相关基因(Runx2、OPN和OCN)的表达也具有相似的趋势,0.2Sr、0.4Sr和0.6Sr组中的表达显著高于PC、p-Mg和0Sr组(P<0.05),而0.6Sr组中的Runx2、OPN和OCN表达均最强。结论:Mg-1Zn-1Sn-xSr(x=0、0.2、0.4和0.6 wt.%)合金具有优异的生物相容性和一定的生物活性。其中,0.2Sr合金与细胞共培养过程中降解速率最慢,析氢量最少,具有最强的促细胞增殖、粘附、扩展和迁移能力,并具有一定的促成骨活性;而0.6Sr合金具有最强的诱导细胞成骨分化的能力。表明了Mg-1Zn-1Sn-xSr合金作为骨科内植物材料的巨大应用潜力。第三部分挤压态Mg-1Zn-1Sn-xSr合金作为骨科内植物材料的体内研究目的:通过皮下植入动物模型探究挤压态Mg-1Zn-1Sn-xSr(x=0、0.2、0.4和0.6 wt.%)合金在体内的生物安全性,组织相容性,析氢和抗腐蚀能力,并挑选出综合性能最佳的2种合金,制备成骨螺钉进一步评估其在股骨髁骨折动物模型中的抗腐蚀性能、骨修复、骨整合以及力学性能,为Mg-1Zn-1Sn-xSr合金体系的临床转化提供理论支撑。方法:1.将12只SD大鼠分为四组(n=3),即对照组、7 d组、15 d组和30 d组,将Mg-1Zn-1Sn-xSr合金样品植入SD大鼠皮下,通过血液学检测SD大鼠肝肾功、Mg离子浓度,采用X线检测及肉眼观察不同时间点皮下产氢情况,并通过HE染色评估重要脏器(心、肝、脾和肾)以及合金样品周围组织病理学变化,最后通过观察合金表面腐蚀情况和计算合金质量丢失情况筛选出在体内抗腐蚀性能最好的两种合金。2.将筛选出的合金制备成骨螺钉,并以p-Mg螺钉作为对照,植入到兔股骨髁骨折动物模型中,采用X线检测观察术后不同时间点螺钉在股骨髁部的产氢情况,采用micro CT扫描观察不同时间点螺钉周围成骨以及螺钉的降解情况,采用硬组织切片染色(品红-亚甲基蓝和甲苯胺蓝染色)评估螺钉周围骨组织的生长和骨-螺钉界面结合情况;通过钙黄绿素-二甲酚橙-盐酸四环素荧光标记示踪了解骨组织的形成速度及生长方式,最后通过推出实验分析骨与螺钉界面之间的结合强度。结果:1.SD大鼠皮下植入实验证实挤压态Mg-1Zn-1Sn-xSr合金具有良好的体内生物安全性和组织相容性,血液学检测表明所有SD大鼠在术后各时间点的肝肾功均在正常参考范围内,与对照组无明显差异(P>0.05);血清镁离子浓度在术后3 d出现轻度上升,并于术后7 d内逐渐恢复至植入前水平;H&E染色结果表明各组SD大鼠的重要组织脏器无明显病理学改变;在皮下植入早期(7 d),所有样品均引起了局部组织的炎症反应,但随着时间的延长,炎症逐渐缓解,其中以0.2Sr合金的炎症反应最轻微,组织相容性最好;X片和肉眼观察均表明,0.2Sr合金在皮下的析氢量最少;通过样品质量丢失推算出的各组合金在体内抗腐蚀性能由强到弱排序依次为:0.2Sr>0Sr>0.4Sr>0.6Sr,腐蚀率分别为0.44±0.02、0.63±0.05、0.89±0.05和0.93±0.04 mm/y。2.将筛选出的0Sr、0.2Sr合金制备成骨螺钉,并以p-Mg螺钉作为对照,植入至兔股骨髁骨折动物模型中。X片中可见p-Mg组产生了大量H2的并积聚在股骨干髓腔中,而0Sr和0.2Sr组中的H2析出量显著降低(P<0.05);micro CT结果显示0.2Sr组具有最好的抗腐蚀性能,在植入24 w后,仍能保持螺钉外形的完整,而p-Mg和0Sr组则出现了不同程度螺钉完整性的丢失;Micro CT、硬组织切片染色和荧光示踪均表明0.2Sr组周围有最多的新骨形成(P<0.05),0Sr组周围的新生骨量也较p-Mg组明显增多(P<0.05)。0.2Sr和0Sr组的BIC比率在术后各时间点均明显高于p-Mg组(P<0.05),其中,0.2Sr组术后24 w的BIC比率达到了78.2±9.1%,显著优于同时期的p-Mg组(42.3±7.9%)和0Sr组(64.5±8.6%);植入12 w后,p-Mg、0Sr和0.2Sr组的推出力分别为408.9±76.5 N、824.2±160.7 N、1101.6±209.8 N,表明0.2Sr组的骨-螺钉界面的结合强度是最强的。结论:1.Mg-1Zn-1Sn-xSr(x=0、0.2、0.4和0.6 wt.%)合金具有良好的体内生物安全性和组织相容性,其中以0.2Sr合金的综合性能最佳。各合金在体内的抗腐蚀性能差异较大,由强到弱依次为:0.2Sr>0Sr>0.4Sr>0.6Sr,总体趋势与体外实验结果保持一致。2.0Sr和0.2Sr组螺钉在体内均具有较p-Mg组螺钉更好的抗腐蚀性能、极低的析氢量和更强的促成骨活性。其中,0.2Sr组表现最为突出,在植入动物体内24 w后仍能保持螺钉的完整性,此外,其还具有比p-Mg和0Sr组更强的促成骨能力,可有效增强骨-螺钉界面的骨整合。
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