小麦是主要的粮食作物,但也可引发多种过敏性疾病和自身免疫性疾病。乳糜泻(CD)是因摄入小麦、大麦或黑麦中的麸质蛋白而引发的慢性小肠炎症性疾病,该病由T细胞介导并具有基因易感性。目前,对乳糜泻尚无特效的治疗方法,唯一可靠的治疗方式是终生严格的无麸质饮食,所以低乳糜泻毒性的小麦产品的加工备受关注。最近研究表明微生物转谷氨酰胺酶(mTG)介导的转谷酰基修饰可以降低麸质蛋白的免疫原性。本研究采用mTG结合小分子酰基受体,L-赖氨酸(Lys)、甘氨酸乙酯(GEE)、盐酸羟胺(HA)、L-赖氨酸甲酯(LME)、6-氨基己酸(6-AA)和正丁胺(BL),转谷酰基修饰小麦麸质蛋白肽33mer(LQLQPFPQPQLPYPQPQLPYPQPQLPYPQPQPF)、T细胞表位DQ2.5-glia-α1a(LQPFPQPQLPYPQ)和DQ2.5-glia-α2(PFPQPQLPYPQPQ)、醇溶蛋白以及小麦面粉;利用反相高效液相色谱(RP-HPLC)、液相色谱-电喷雾串联质谱(LC-ESI-MS)和基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF)探索转谷酰基修饰对麸质蛋白肽的性质和结构的影响;使用增强线性离子阱回旋组合质谱仪(LTQ-FT Ultra-MS)鉴定转谷酰基修饰位点;基于酶联免疫技术,使用R5ELISA和G12 ELISA评估转谷酰基修饰肽和蛋白的免疫反应活性;基于T细胞表位,使用抗DQ2.5-glia-α1a和抗DQ2.5-glia-α3单抗评估转谷酰基修饰蛋白的免疫反应活性;并利用来自于乳糜泻患者的麸质蛋白特异性T细胞评估转谷酰基修饰多肽和蛋白的乳糜泻毒性;最后探索组织转谷氨酰胺酶(tTG)对mTG转谷酰基修饰后的醇溶蛋白肽的结构以及乳糜泻毒性的影响。将为低乳糜泻小麦制品的研发提供理论和试验依据。本研究的主要结果和结论如下:1基于优化的转谷酰基反应条件,mTG一步催化反应得到的转谷酰基修饰产物纯度大于99%,且mTG转谷酰基形成的异肽键具有较强的稳定性。2 pH对mTG催化的转谷酰基修饰反应没有显著影响,但对mTG催化的脱氨基反应有很大影响。在酶活性有效范围内,mTG的脱氨基活性在酸性pH下较强。3 Lys、GEE和HA都导入在相同的谷氨酰胺残基上,且转谷酰基修饰位点与mTG/tTG催化的脱氨基修饰位点相同。因此,mTG催化的转谷酰基反应可以抑制谷氨酰胺残基的脱氨基化,而影响麸质蛋白和多肽的乳糜泻毒性。4基于单克隆抗体的竞争ELISA技术评估转谷酰基修饰多肽的免疫反应活性。使用R5 ELISA测得Lys、LME、GEE、6-AA和HA转谷酰基修饰后的33mer与R5抗体反应的多肽含量分别降低至对照组的2.57%、1.59%、0.98%、1.66%和5.17%;使用G12 ELISA测得与G12抗体反应的多肽含量则分别是对照组的26.21%、29.59%、29.96%、30.26%和50.22%。5使用麸质蛋白特异性T细胞评估转谷酰基修饰多肽和醇溶蛋白的免疫原性,发现Lys转氨酰胺修饰能最有效消除麸质蛋白和多肽对T细胞免疫原性,其次是GEE,而HA转谷酰基修饰则对麸质蛋白和多肽的免疫原性影响较小。6基于T细胞表位和ELISA技术的检测结果表明,转谷酰基修饰能降低小麦粉馒头中麸质蛋白的乳糜泻毒性。7 tTG可以催化mTG转谷酰基反应的逆反应,并进一步导致脱氨基反应的发生。随着tTG孵育时间延长,tTG催化转谷酰基反应的逆反应的程度增加。细胞实验结果表明,tTG处理增强了转谷酰基修饰多肽的免疫原性;虽然tTG处理的转谷酰基修饰醇溶蛋白的免疫原性虽有所增强,但相比于阳性对照,免疫原性已有很大程度下降。总之,mTG介导的小分子酰基受体的转谷酰基修饰具有降低麸质多肽和蛋白乳糜泻毒性的潜力,为从食品源头上解决乳糜泻问题提供新的策略。另外,tTG可催化mTG转谷酰基反应的逆反应,致使麸质蛋白和多肽具有乳糜泻毒性。因此,在评价食品的乳糜泻毒性时,需要考虑tTG的作用。本研究发现,有助于提高医学和食品领域研究者对乳糜泻患者特殊膳食的认识,促进乳糜泻的预防和控制以及无麸质食品的研发。