论文部分内容阅读
目的:化疗导致的口腔黏膜炎(oral mucositis,OM)是一种由于化疗药物的毒性作用而引起口腔黏膜或周围软组织急慢性炎症反应的疾病,通常表现为口腔干燥、疼痛、溃疡等症状,影响患者生活质量,严重的甚至会导致肿瘤治疗的中断;因此,临床医生希望该疾病可以得到有效预防或者快速治疗。本研究通过构建化疗导致金黄地鼠口腔黏膜炎的动物模型;培养和鉴定金黄地鼠脂肪来源间充质干细胞;并将提取的金黄地鼠脂肪干细胞(adipose-derived stem cell,ADSCs)进行标记,注射于金黄地鼠颊囊溃疡周围,研究ADSCs对化疗导致的口腔黏膜炎的治疗效果。为ADSCs治疗化疗导致的口腔黏膜炎提供实验依据,对今后ADSCs用于口腔黏膜组织修复打下一定的基础。方法:1.利用大量文献和预初实验确定建模时所需的药物剂量和频次,通过对金黄地鼠腹腔注射化疗药物5-氟尿嘧啶并刮擦颊囊黏膜建立口腔黏膜炎动物模型,并同正常对照组对比,分析建模结果。2.提取金黄地鼠脂肪干细胞并传代培养,同时检测其诱导分化的能力。3.将提取的金黄地鼠脂肪干细胞传至第3代,用CM-Dil细胞膜探针标记细胞,将标记好的细胞注射到金黄地鼠颊囊溃疡周围,注射细胞量为2×106个,观察ADSCs在动物体内存活情况,并与未注射ADSCs组比较口腔黏膜炎愈合情况。结果:1.正常对照组金黄地鼠进食量无明显变化,平均体重随时间逐渐增加,实验组从第5天开始,进食量减少,体重明显下降,第14天后,进食逐渐恢复,体重逐渐增加;实验组同对照组相比,颊囊黏膜充血,局部刮擦区在第5天形成典型溃疡,到第14天,溃疡稍愈合,一般到第21天后溃疡基本愈合;实验组口腔黏膜HE染色发现:上皮完整性已经破坏,下方大量炎症细胞浸润,固有层胶原纤维水肿,毛细血管扩张充血,到第21天,大部分病灶被上皮封闭,上皮层厚度不一,个别粘膜下肌层出现疤痕修复;对照组口腔黏膜HE染色发现上皮完整,层次清晰,无炎性细胞浸润。2.提取的ADSCs在光学显微镜下观察发现,细胞贴壁后呈成纤维细胞样形态,3~5d细胞开始成倍增殖,6~7d后细胞融合可达80%,培养至第3代后,细胞形态均一。传代8次以上,各代细胞仍保持原有形态,细胞增殖速度无明显减慢。将第3代ADSCs进行成脂诱导,诱导第3天后,胞浆内出现脂滴并逐渐聚集;诱导2周后发现细胞体积增大,胞浆内充满圆形脂滴呈葡萄串状,进行油红O染色,在光学显微镜下可看到圆形细胞内明显的亮红色颗粒;未诱导细胞仍为正常ADSCs形态,油红O染色后细胞内无明显红色颗粒。3.CM-Dil标记的ADSCs在体外培养后细胞仍呈梭形并处于增殖状态,生长良好,细胞透光性好,形态完整,细胞碎片少;荧光显微镜下可见被标记的细胞发出与膜染一致的环状红色荧光,细胞核未被荧光标记。细胞移植后所有的金黄地鼠均存活,无移植后不良反应。实验组在ADSCs移植后第3天溃疡面开始缩小,第7天溃疡几乎完全消失,对照组愈合时间平均为20天。将移植后第3天和第8天对照组与实验组标本行冰冻切片处理,用荧光显微镜观察标本发现:ADSCs在第3天和第8天细胞活性良好,并聚集于口腔黏膜溃疡周围。结论:1.对金黄地鼠进行腹腔注射5-氟尿嘧啶并刮擦颊囊黏膜可以建立稳定可靠的化疗导致口腔黏膜炎动物模型,且在刮擦部位出现溃疡。2.金黄地鼠脂肪干细胞提取培养方法简单易行,脂肪干细胞在体外增殖迅速,分化能力强,可以作为治疗口腔黏膜炎、修复黏膜损伤的种子细胞。3.脂肪干细胞移植可以明显缩短金黄地鼠颊囊溃疡愈合时间,对化疗导致的口腔黏膜炎有一定的治疗效果。