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目的:构建乙型肝炎表面抗原(HBsAg)和弓形虫致密颗粒抗原-1(GRA1)融合基因真核表达载体pcDNA3-HBsAg-GRA1,观察该二价DNA疫苗的保护性.方法:1.构建融合基因表达载体pcDNA3-HBsAg-GRA1采用聚合酶链反应(PCR)扩增出HBsAg前224个氨基酸的编码基因,用BclⅠ/EcoRⅠ双酶切、纯化;PCR扩增出GRA1的编码基因,用EcoRⅠ/XhoⅠ双酶切、纯化;用BamHⅠ/XhoⅠ双酶切真核表达质粒pcDNA3、并纯化;将HBsAg-GRA1定向克隆到pcDNA3的BamHⅠ/XhoⅠ位点;对重组子进行PCR扩增、双酶切初步鉴定后做序列测定;2.构建pcDNA3-HBsAg真核表达载体PCR扩增出编码HBsAg226个氨基酸的基因,用Hind Ⅲ/EcoRⅠ双酶切真核表达质粒pcDNA3,将HBsAg226氨基酸的编码基因定向克隆到pcDNA3 Hind Ⅲ/EcoRⅠ位点,对重组子进行PCR扩增、双酶切初步鉴定后做序歹测定;3.将融合基因真核表达载体pcDNA3-HBsAg-GRA1转染入体外培养的COS-7细胞,培养48h后收集COS-7细胞,采用ELISA、SDS-PAGE、Western blot检测表达蛋白的生化特性和免疫活性;4.大量提取重组质粒pcDNA3-HBsAg-GRA1、pcDNA3-HBsAg、pcDNA3-GRA1、及空质粒pcDNA3,通过肌肉注射免疫BALB/c小鼠,ELISA法检测抗体及抗体亚类水平,PCR检测肌肉组织DNA中HBsAg、GRA1编码基因,用弓形虫速殖子分别攻击感染免疫鼠及对照鼠,观察比较其存活时间.结果:1.成功构建重组融合基因真核表达质粒pcDNA3-HBsAg-GRA1,序列测定表明已将大小为1245bp的HBsAg-GRA1融合基因定向克隆到pcDNA3的BamHⅠ/XhoⅠ位点;2.成功构建乙肝表面抗原真核表达质粒pcDNA3-HBsAg,序列测定表明已将大小为678bp的HBsAg主蛋白S蛋白完整开放阅读框定向克隆到pcDNA3的Hind Ⅲ/EcoRⅠ位点;3.成功将pcDNA3-HBsAg-GRA1转染入COS-7细胞,且表达了具有免疫活性的融合蛋白,分别被HBsAb阳性血清及弓形虫免疫兔血清识别.4.经pcDNA3-HBsAg-GRA1免疫的小鼠血清中GRA1抗体明显高于pcDNA3-GRA1组及混合免疫组;HBsAb阳性,滴度达1:800,各免疫组之间无明显差异;弓形虫RH株攻击后,pcDNA3-HBsAg-GRA1免疫组存活时间明显长于其他各组.结论:成功构建pcDNA3-HBsAg-GRA1、pcDNA3-HBsAg真核表达质粒,动物保护实验初步结果显示将GRA1融合于HBsAg的第224个氨基酸处,增强了GRA1的免疫保护性,并优于混合免疫组,HBsAg可能作为蛋白载体起了佐剂样作用.