一、两种不同预处理方式建立小鼠异基因造血干细胞移植急性移植物抗宿主病（aGVHD）模型目的:利用两种不同的预处理方式建立小鼠异基因造血细胞移植aGVHD模型。方法:25只SPF级BALB/c小鼠分为5组,分别接受7、7.5、8、8.5、9Gy ⁶⁰Coγ射线全身照射。C57BL/6（H-2^b,♂）小鼠为供鼠,BALB/c小鼠（H-2^d,♀）为受鼠。20只BALB/c小鼠经预处理后随机分为4组,分别尾静脉输注1×10⁶、2.5×10⁶、5×10⁶、10×10⁶个骨髓细胞重建造血。在能重建造血的基础上建立aGVHD模型,输注10×10⁶个骨髓细胞基础上再输注1×10⁶、2.5×10⁶、5×10⁶或10×10⁶个脾细胞。减弱强度的预处理方式用药物加小剂量的辐照方式,于移植前第8天开始腹腔注射氟达拉滨（fludarabine; 200mg/kg）至第4天,接着腹腔注射环磷酰胺（cyclophoshpamide; 60mg/kg）至移植前1天,最后在移植前⁶⁰Coγ射线全身照射（4Gy）,建立aGVHD模型,观察小鼠生存状态及生存率。HE染色检测靶器官病理组织切片,流式细胞术检测小鼠嵌合度。结果:接受TBI 7,7.5,8,8.5和9Gy预处理的小鼠中,照射7Gy小鼠全部存活,照射7.5Gy小鼠中位生存期为31天,40天60%死亡。照射8Gy小鼠中位生存期为21天,40天内80%死亡。照射8.5Gy小鼠中位生存期为14天,40天内100%死亡。照射9Gy小鼠中位生存期为8天,40天内100%死亡。采用Log-rank检验分析生存时间,χ²=24.72, P<0.0001。输注5×10⁶骨髓细胞可全部重建造血,100天生存率为100%。单纯输注骨髓细胞不会诱发aGVHD。低剂量脾细胞输注小鼠aGVHD程度轻,40%出现aGVHD性相关死亡;5×10⁶剂量脾细胞输注小鼠100%出现aGVHD相关死亡,疾病严重程度属于中等,中位生存期为19天。10×10⁶剂量脾细胞输注小鼠100%出现aGVHD相关死亡,疾病严重程度属于重度。5×10⁶剂量脾细胞组出现典型的aGVHD病理表现,21天后为完全供体嵌合状态。减弱强度的预处理方式建立的模型,选用中等强度的脾细胞（5×10⁶）,骨髓细胞为（1×10⁷）;其中位生存期为18天,21天后为供受体混合嵌合状态。结论:8.5Gy TBI对于BALB/c小鼠是清髓性照射剂量。预处理后输注5×10⁶个骨髓细胞可全部重建造血。输注5×10⁶个脾细胞可诱发中度程度aGVHD;而输注10×10⁶个脾细胞可诱发严重程度aGVHD。二、硼替佐米对宿主DC的调节作用及其对aGVHD的影响目的:蛋白酶体抑制剂硼替佐米移植后早期注射（移植后0-2天）可以预防aGVHD的发生。本研究旨在探讨硼替佐米对宿主DC的调节作用及其对aGVHD的影响。揭示硼替佐米在移植后早期注射延缓aGVHD是通过其对DC成熟与功能的抑制作用实现的。方法:体外在GM-CSF和IL-4条件下利用骨髓来源培养的DC,经过不同浓度硼替佐米处理后,流式细胞术检测协同共刺激分子CD40、CD80、CD86及MHC-II类抗原表达。用经过不同浓度硼替佐米处理后的DC加入OVA肽段,与OT-I小鼠磁珠分离CD8+T细胞共育。胞内染色观察CD8+T细胞IL-2、IFN-γ和TNF-α表达情况,同时检测上清中上述三种细胞因子的分泌量。EMSA检测经过不同浓度硼替佐米预处理的DC的NF-κB的入核活性。利用骨髓来源的培养DC经过不同浓度硼替佐米预处理后的DC与异基因小鼠脾细胞共育,[3H]-TdR掺入法检测硼替佐米处理后DC对异基因淋巴细胞增殖的影响。体内利用硼替佐米预处理的宿主DC输入到aGVHD小鼠体内,观察小鼠生存状态及生存率。结果:小鼠骨髓来源的细胞在GM-CSF（10ng/mL）和IL-4（1 ng/mL）培养7天后CD11c阳性率为85%以上。经过不同浓度硼替佐米处理的DC在LPS刺激后,CD40、CD80、CD86及MHC-II类抗原表达下调,呈现出明显的剂量依赖性。经过硼替佐米处理的DC与OT-I CD8+T细胞共育后检测胞内细胞因子流式图显示:CD8+TNF-α+T和CD8+INF-γ+T细胞数目逐渐减少,呈现出剂量依赖性。细胞上清细胞因子检测显示:CD8+T分泌TNF-α和INF-γ量逐渐减少,而IL-2的水平并无明显变化。EMSA结果显示,经过硼替佐米预处理的imDC在LPS刺激条件下NF-κB入核量减少,并且呈现出浓度依赖性。经过不同浓度硼替佐米处理的DC与异基因脾细胞进行MLR实验结果显示:DC在经硼替佐米（2nM、10nM和50nM）处理后,其激活异基因T细胞增殖的能力随着硼替佐米浓度的增高而逐渐减弱。经过50nM硼替佐米处理后的1×10⁶宿主DC输入aGVHD模型小鼠后,其生存率要明显高于未用硼替佐米处理而过继输入DC的aGVHD小鼠模型。结论:经过硼替佐米处理的DC其成熟受到抑制,继而其抗原递呈能力下调,导致激活同种异基因淋巴细胞的增殖能力减弱。主要机制是抑制了NF-κB的入核活性。移植后早期注射硼替佐米可能使宿主DC功能下调,降低了异基因抗原的递呈,从而预防了aGVHD的发生。三、TLR4通路与IL-1β在硼替佐米延迟注射促进aGVHD过程中的作用目的:蛋白酶体抑制剂硼替佐米移植后延迟注射（移植后3天以后）可以促进aGVHD的发生。本研究旨在探讨TLR4通路与IL-1β在延迟注射硼替佐米促进GVHD中的作用。方法:体外系统模拟延迟注射与即时注射硼替佐米对DC和巨噬细胞细胞因子分泌的影响。培养骨髓来源的C57BL/6背景DC,于培养第7天LPS刺激,在LPS刺激前或刺激后加入硼替佐米。实验分四组:①延迟硼替佐米组:LPS（100ng/mL）刺激6 h后,加入不同浓度硼替佐米共育,24 h后检测细胞因子浓度。②即时硼替佐米组:先加入不同浓度硼替佐米,6 h后再加入LPS （100ng/mL）刺激。③LPS对照组:直接加LPS刺激。④硼替佐米对照组:直接加不同浓度硼替佐米共育。利用上述方法处理的DC与异基因淋巴细胞进行MLR反应,[3H]-TdR掺入法检测硼替佐米处理后DC对T淋巴细胞增殖影响; ELISA法同时检测上清中细胞因子TNF-α和IL-1β水平。体内采取三种不同的方式对aGVHD动物模型进行干预,研究TLR4通路与硼替佐米延迟干预互作对aGVHD进程的影响。（1）阻断TLR4通路对硼替佐米延迟注射促进aGVHD的影响。用TLR4 KO小鼠做为受体,BALB/c为供体,单纯辐照法（9.0Gy）建立小鼠GVHD模型,实验分即时注射硼替佐米组、延迟注射硼替佐米TLR4 KO组、延迟注射硼替佐米C57BL/6组、aGVHD C57BL/6模型对照组和aGVHD TLR4 KO模型对照组,观察各组小鼠注射硼替佐米后的生存状态及生存率。（2）移植前预处理产生的不同LPS水平对硼替佐米延迟注射促进aGVHD的影响。运用氟达拉滨加小剂量照射（4Gy）预处理方式建立小鼠aGVHD模型,检测不同时间小鼠体内的LPS水平;观察小鼠延迟注射硼替佐米生存率;同时根据体外模拟实验结果设上调体内LPS浓度实验,分GVHD模型对照组,延迟注射硼替佐米组,LPS+延迟注射硼替佐米组（建模第3天给GVHD模型鼠先腹腔注射LPS（5 mg/kg）,6 h后注射硼替佐米1次）和LPS对照组（实验第3天给GVHD模型鼠注射LPS（5 mg/kg） 1次）。观察小鼠生存状态及生存率。（3）阻断炎性因子IL-1β对硼替佐米延迟注射促进aGVHD的影响。大剂量辐照法建立小鼠aGVHD模型:选用SPF级接受8.5Gy致死剂量⁶⁰Co辐照的BALB/c小鼠作为受鼠,尾静脉移植入C57BL/6小鼠1.0×10⁷骨髓细胞和0.5×10⁷脾细胞,建立小鼠aGVHD模型。骨髓移植后第1,3和5天取血,LAL法检测小鼠LPS血清水平;同时检测延迟注射硼替佐米组（骨髓移植后第3天注射,连续2天）、即时注射硼替佐米组（骨髓移植后连续注射2天）和GVHD模型组的Th1 （IFN-γ）,Th2 （IL-4）、TNF-α与IL-1β血清水平。用上述方法建立小鼠aGVHD模型,实验分即时注射硼替佐米组、延迟注射硼替佐米组、阿那白滞素阻断IL-1β组（骨髓移植后连续注射2天阿那白滞素）和阿那白滞素阻断IL-1β+延迟注射硼替佐米组（骨髓移植后注射阿那白滞素阻滞IL-1β2天,第3天注射硼替佐米）。于延迟注射硼替佐米后小鼠濒死时免疫组织化学法检测各组小肠TNFR的表达;ELISA法检测血清细胞因子浓度;计算GVHD积分;观察GVHD各组各个脏器（肝脏、皮肤、肺及小肠）HE染色病理组织切片及生存率。结果:原代培养的DC在先LPS刺激6 h后与不同浓度硼替佐米的作用下比单用LPS刺激分泌的IL-1β显著增高（P<0.01）;而TNF-α则无上述现象。我们用同样的方法也检测了巨噬细胞,未发现差异。经延迟和即时处理的DC与同种异基因小鼠的脾细胞共育进行MLR实验,[3H]-TdR法检测异结果显示:较高浓度硼替佐米（50nM和10nM）延迟处理的DC其激活同种异基因淋巴细胞的能力要比LPS组和即时组都要强（P<0.01）。延迟模拟组IL-4水平有显著意义上升（P<0.05）。延迟给药aGVHD小鼠血清细胞因子浓度结果显示:延迟注射硼替佐米aGVHD组与aGVHD模型组或即时注射硼替佐米aGVHD组比,移植后第4天小鼠IL-1β和IFN-γ水平升高。TLR4敲基因建立的aGVHD模型,在延迟注射硼替佐米后不会立即死亡,且其生存率要显著高于C57BL/6对照组和TLR4 KO模型对照组;而C57BL/6延迟注射组小鼠会立即死亡。运用氟达拉滨加小剂量辐照法与大剂量单独辐照法建立的小鼠aGVHD模型相比,前者早期体内LPS升高不明显。不同预处理产生的LPS水平不同,在氟达拉滨加小剂量辐照组骨髓移植后,第1,3和5天的LPS水平分别为（0.17±0.02 ）Eu/mL、（0.21±0.04 ）Eu/mL和（0.23±0.05）Eu/mL;而大剂量辐照预处理组则为（0.27±0.02）Eu/mL、（0.47±0.02）Eu/mL和（0.69±0.04）Eu/mL。两种方式比较结果:大剂量辐照组LPS浓度显著高于氟达拉滨加小剂量辐照组（P<0.01）。氟达拉滨加小剂量辐照组LPS水平相对稳定,而大剂量辐照组则呈现出逐渐上升趋势。运用氟达拉滨与小剂量照射预处理方式建立的小鼠GVHD模型在延迟注射硼替佐米后生存期明显比大剂量辐照组延长;在上调LPS实验中,LPS+延迟注射硼替佐米组与LPS对照组存在明显差异,肠道肿胀,炎症表现。辐照法建立aGVHD模型后,用阿那白滞素阻断IL-1β可以明显延长延迟注射硼替佐米小鼠的生存率。血清中IFN-γ与TNF-α下降,IL-4上升。组织病理变化、体重变化、体内炎性因子变化均有差异。结论:移植后期预处理造成肠道损伤,LPS激活TRL4通路,此时注射硼替佐米促进了IL-1β的分泌,放大“炎性风暴”,继而过度激活宿主DC细胞及供者T细胞而促进GVHD进程。证明了TLR4信号通路激活是引发硼替佐米延迟注射导致GVHD相关性死亡的重要原因;并研究不同的预处理方式会导致机体产生不同水平的LPS,从而激活TLR4通路信号的强度不同,最终在延迟注射硼替佐米促进GVHD相关性死亡中起到重要作用;IL-1β在延迟注射硼替佐米促进aGVHD的进程中起到了放大“炎性风暴”的关键作用。