淋巴瘤由于其分类复杂，对其诊断主要依赖形态学和免疫组织化学方法，Southern blot也曾成为诊断淋巴瘤的“金标准”，但是都有其缺陷，形态学和免疫组织化学虽然能有助于正确的诊断和分类，但是仍然有一部分病例不能得到确诊，Southern blot借助分子病理学的方法对淋巴瘤进行诊断特异性和敏感性较高，但是由于其存在以下局限性，如费时，要求的DNA质量较高(10-20μg)，不适于在临床常规推广开展。聚合酶链反应(PCR)快捷，方便，用于淋巴瘤的诊断受到人们的关注。Southern blot和PCR检测淋巴瘤的理论依据在于：肿瘤的所有细胞均来源一个克隆(clone)，理论认为正常发育的B细胞和T细胞分别经过免疫球蛋白(immunoglobulin, Ig)基因重排和T细胞受体重排(T cell receptor, TCR)。淋巴组织良性增生性疾病中表现为Ig基因和(或)TCR基因多克隆重排。而肿瘤细胞起源于一个克隆，在淋巴瘤中就表现为Ig基因或者TCR基因单克隆重排。PCR检测淋巴瘤的克隆性正式检测淋巴瘤的Ig基因重排和TCR基因重排。目前淋巴瘤的分子病理诊断在临床实践中存在以下几方面问题：首先，以往研究Ig基因克隆性重排主要集中在重链(heavy chain)可变区基因，之所以IgH成为检测的首选目标，主要的原因是大多数的B细胞肿瘤有IgH基因重排，IgH基因重排发生在IgL基因重排之前，一些B细胞恶性肿瘤尤其是一些前体淋巴母细胞白血病和淋巴瘤部分没有进行IgL基因重排。第二方面，目前，世界范围内在应用IgH重排检测淋巴瘤时还有不少困难，如假阳性、假阴性、双克隆以及寡克隆的意义等问题。世界各国还在寻找各种方案解决这些问题，其中BIOMED-2方案的出现就是其中之一，BIOMED-2方案是欧洲7个国家的47个研究所合作产生的一个关于淋巴瘤分子病理诊断的方案。该方案的产生旨在对淋巴瘤分子病理诊断方案的规范化和标准化，但是目前的方案体系太复杂，一个PCR反应体系需要多条引物，如IgH PCR的反应体系多大21条引物之多，根据该方案的设计，完成一例淋巴瘤检测成本会很高。鉴于此，这个方案目前还在改进、简化和探索中。值得注意的是，多年来人们都依据IgH来进行克隆性检测，而在应用IgL方面，临床实践和研究均不多。理论上认为轻链由于其CDRs区的体细胞超突变可能低于重链CDRs区。目前关于轻链克隆性重排研究的资料积累有限，但是理论上和已经发表的一些研究成果可知在淋巴瘤中对轻链的研究在一定程度上能够辅助重链克隆性重排检测。因而我们依据我们多年的工作基础和实验室现有条件，对IgL在淋巴瘤分子病理诊断中的作用作初步的研究，以期为临床应用提供依据。第三方面，目前现有研究表明，IgH基因克隆性重排检测与淋巴瘤的起源有紧密的联系。来源于幼稚淋巴细胞，也称为生发中心前(pregerminal centre, pre-GC)幼稚B细胞的肿瘤，通常表达未突变的IgH可变区(VH)基因，显示有高的IgH克隆性重排检测率，而另一些来源于记忆性B细胞，在生发中心(germinal center, GC)发生的的肿瘤细胞通常有体细胞超突变的VH基因(GC和post-GC记忆B细胞)，显示有较低的克隆性重排检测率。Ig基因的CDRs体细胞超突变允许抗体和靶抗原亲合力成熟而导致B细胞选择。这些体细胞突变也会发生在FR，FR区是大多数通用和家族引物设计区。突变得最终结果就是导致一致靶序列丢失还有靶位点的改变，该改变会影响引物得最佳匹配。通用性引物和家族性引物的总体上来讲对相当一部分的基因是最适的，但是对其它一部分基因也显示了较低的同源性。第四方面，早期报道的淋巴瘤基因检测中存在双重重排的现象，当前的观点认为免疫表型为B细胞或者T细胞的淋巴瘤同时发生IgH基因及TCR基因的克隆性重排称为双重重排(dual rearrangements)。同时也有研究报道免疫表型为B细胞的淋巴瘤同时发生IgH两个等位基因的克隆性重排称为双克隆重排(biclonal rearrangement)；T细胞中发生两个等位基因的克隆性重排也称为双克隆重排。本文中所涉及的双重重排现象指同时发生IgH基因和TCR基因的克隆性重排。克隆性双重重排的现象逐渐受到关注，PCR检测到的双重重排的淋巴瘤是否真正发生了双重重排?其临床预后同一般发生重排的淋巴瘤有何不同?其发生机制又是怎样?依据重排机制，B-NHL先发生IgH重排，重排成功发生Igκ重排，而后发生Igλ重排，对于双重重排研究引入轻链重排的概念，可以初步尝试揭示PCR检测到的双重重排是否真正发生了双重重排，及对双重重排的发生机制做一些初步的探讨。鉴于以上资料，本研究首先采用PCR方法，联合FR3A、FR2A及TCRγ引物，检测77例B-NHL的IgH基因及TCRγ基因克隆性重排，测定IgH基因克隆性重排在本实验室B-NHL中的检测率，研究IgLPCR在B-NHL中的应用，同时选出双重重排的病例进一步通过DNA测序技术和轻链基因克隆性重排研究双重重排的现象。材料与方法1材料(1) NHL标本：收集1997-2007年我医学院附属医院及省内其它医院的B-NHL标本77例，全部标本经中性福尔马林固定、常规石蜡包埋、4～5μm连续切片，除常规HE染色外，采用LCA(2B11，DAKO)、CD3(F7.2.38，DAKO)，CD45RO(OPD4，DAKO)、CD20(L26，DAKO)免疫组化S-P法标记淋巴细胞亚群，根据肿瘤的免疫表型，确定为B-NHL，按照2000年WHO关于淋巴及造血系统肿瘤分类标准对所有病例进行分类，kappa light chain(L1C1, DAKO)和lambda light chain(LAM03+HP6054, DAKO)标记轻链。(2)对照组标本：收集反应性淋巴结炎石蜡标本2例。2方法(1)经典蛋白酶K-酚氯仿法抽提石蜡组织DNA。(2)采用PCR方法，联合FR3A、FR2A及TCRγ引物，检测77例NHL标本IgH基因及TCRγ基因克隆性重排，产物先2％琼脂糖电泳初筛，后行8％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。(3)采用PCR方法，检测IgL基因克隆性重排，包括Igr基因克隆性重排和Igλ基因克隆性重排，产物先经2％琼脂糖电泳初筛，后行8％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。克隆测序分析。结果1．采用FR3A引物，克隆性IgH基因重排在77例B-NHL中检测率为62.3％(48／77)，联合FR3A、FR2A引物，总检测率为75.3％(58／77)。2．联合FR3A、FR2A及TCR_γ引物，6.5％(5／77)NHL初步检测到发生双重重排。免疫组化结果提示这5例均为B细胞表型。病理类型分别为2例弥漫大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、2例MALT-MZL及1例滤泡性淋巴瘤(FL)。3．克隆性Igκ基因重排在77例B-NHL中检测率为11.7％(9／77)，克隆性Igλ基因重排检测率为6.5％(5／77)，联合IgL基因重排，克隆性基因重排在77例B-NHL中检测率是18.2％(14／77)。结论1．采用FR3A引物，克隆性IgH基因重排在B-NHL中检测率为62.3％，联合FR3A、FR2A引物，可提高检测率到75.3％。2．Igκ基因重排克隆性分析检测率11.7％，Igλ基因重排克隆性分析检测率6.5％，克隆性IgH基因重排检测率是18.2％，联合应用IgH和IgL基因克隆性分析能够提高检测率(从75.3％到84.5％)。克隆性IgL基因重排能提高淋巴瘤的检测率。3．双重重排现象在我们实验室恶性淋巴瘤中的初步检测率为6.5％。病理类型集中在DLBCL、MALT-MZL、FL。4．对高度怀疑为淋巴瘤的临床病理标本进行克隆性重排检测时，必须对同一样本同时检测IgH和TCR基因，才能保证结果的完整性和真实性，两者缺一不可。