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Ghrelin是一种具有多种生物学功能的外周多肽类激素,能够促进生长激素分泌和胃肠道蠕动、调节食欲和能量代谢、改善免疫和记忆力等。然而家禽Ghrelin对食欲和脂肪代谢的调控作用不同于哺乳动物,表现为抑制食欲和促进脂肪分解,深入研究家禽Ghrelin的生物学功能具有重要意义。本课题通过建立动物模型和细胞模型来开展研究,以确定鸡Ghrelin的分泌规律和影响分泌的因素,阐明鸡Ghrelin调控脂肪代谢的作用机制。(1)Ghrelin时空表达规律。利用不同品种的鸡来研究Ghrelin在不同组织器官(腺胃、十二指肠、肝脏、腹部脂肪、胸肌和腿肌)和不同生理阶段(AA肉仔鸡:1/2/3/4/5/6/7 W,海兰褐蛋鸡:4/6/8/10/12/16 W)的表达,发现Ghrelin mRNA和GHSR1a mRNA的表达情况类似,都是在腺胃中的表达量最高,其次是在十二指肠、肝脏和腹部脂肪,在胸肌和腿肌中表达量最低。Ghrelin mRNA和GHS-R1a mRNA在不同组织器官的表达趋势不同,且在单一组织器官中的表达具有波动性,这种变化应该是由于动物生长发育的阶段性与不平衡性引起。(2)影响Ghrelin分泌的因素。通过改变AA肉仔鸡的营养状态(采食状态、日粮能量水平、灌服葡萄糖)和激素水平(胰岛素和糖皮质激素)来建立动物模型,检测血清中Ghrelin浓度以及下丘脑、腺胃、十二指肠、肝脏、腹部脂肪、胸肌和腿肌中Ghrelin mRNA和GHS-R1a mRNA的表达情况。AA肉仔鸡禁食12 h和禁食10 h后再饲喂2 h与自由采食组相比循环中Ghrelin的分泌增加,Ghrelin mRNA和GHS-R1a mRNA在各个组织中的表达发生相应改变。葡萄糖(7.5 ml/kg体重,0.27 g/ml)和胰岛素(40μg/kg体重)是正能量状态的信号,处理AA肉仔鸡后循环中Ghrelin的浓度增加,连续7天注射地塞米松(DEX,2.0 mg/kg体重)导致AA肉仔鸡负能量状态,循环中Ghrelin浓度增加,Ghrelin mRNA和GHS-R1a mRNA在各个组织中的表达发生相应改变。日粮能量水平对肉仔鸡循环中Ghrelin的浓度无显著影响。试验中Ghrelin mRNA和GHS-R1a mRNA在下丘脑、肝脏、腹部脂肪和骨骼肌中的显著变化提示着Ghrelin参与能量代谢调节。(3)Ghrelin调控脂肪代谢的作用机制。家禽脂肪代谢不同于哺乳动物,肝脏是脂肪从头合成的主要部位,脂肪组织主要作为脂肪储存器官,骨骼肌是机体能量利用的主要器官,选择这三种器官进行原代细胞培养,作为研究鸡Ghrelin调控脂肪代谢作用机制的体外模型。通过使用合成的鸡酰基化Ghrelin多肽处理,检测脂肪代谢、细胞能量呼吸和信号通路相关指标。改变细胞培养条件(胎牛血清、葡萄糖、脂肪酸、胰岛素和DEX),检测Ghrelin mRNA和GHS-R1a mRNA的表达情况。AA肉仔鸡:肉仔鸡(禁食12 h和自由采食)腹腔注射Ghrelin(10μg/100g体重)后,无论是在自由采食状态还是禁食状态血清中葡萄糖(GLU)和甘油三酯(TG)水平显著降低,相对而言肉仔鸡在饲喂状态下对Ghrelin更敏感,作用效果更显著。肝细胞:Ghrelin(0.7μM)处理不影响肝细胞的活力。通过检测细胞TG含量和油红染色发现Ghrelin减少了细胞内脂肪的沉积。Ghrelin促进了GHS-R1a mRNA和乙酰辅酶A羧化酶(ACC)、肉碱棕榈酰转移酶1(CPT1)、过氧化物酶体增殖物激活受体α(PPARα)等脂肪代谢相关基因mRNA的表达,抑制了脂肪酸合成酶(FAS)mRNA的表达。Ghrelin促进了肝细胞线粒体有氧呼吸过程中的基础呼吸、质子渗漏、ATP产量,抑制了偶联效率,对糖酵解过程无显著影响,细胞线粒体功能尚待进一步探究。Ghrelin促进了AMPK、ACC、CPT1、过氧化物酶体增殖物活化受体γ辅助活化因子1α(PGC-1α)和PPARγ蛋白的表达,促进了细胞对脂肪酸的摄取,但抑制了细胞对葡萄糖的摄取,添加单磷酸腺苷激酶(AMPK)抑制剂Compound C后抑制了Ghrelin诱导的作用。改变培养基中葡萄糖浓度后不影响Ghrelin mRNA的表达,葡萄糖浓度为零和加倍时抑制了GHS-R1a mRNA的表达。脂肪酸处理增加了细胞内TG的积累,饱和脂肪酸比不饱和脂肪酸更显著的抑制了细胞中Ghrelin mRNA和GHS-R1a mRNA表达。细胞营养供应改变(胎牛血清是否供应),AMPK-2αmRNA、Ghrelin mRNA和GHS-R1a mRNA的表达随之发生显著变化。DEX处理3 h促进Ghrelin mRNA和GHS-R1a mRNA的表达,处理12 h促进GHS-R1a mRNA表达,处理24 h抑制GHS-R1a mRNA表达。胰岛素抑制Ghrelin和GHS-R1a mRNA的表达。脂肪细胞:Ghrelin(0.7μM)处理不影响脂肪细胞的活力。通过检测细胞TG含量和油红染色发现Ghrelin减少了细胞内脂肪的沉积。Ghrelin促进GHS-R1a mRNA和CPT1、PPARγ等脂肪代谢相关基因mRNA的表达,抑制ACC mRNA的表达,对FAS mRNA的表达无显著影响。Ghrelin促进了AMPK、ACC、CPT1、PGC-1α和PPARγ蛋白的表达,促进了细胞对脂肪酸的摄取,但抑制了细胞对葡萄糖的摄取,添加AMPK抑制剂Compound C后抑制了Ghrelin诱导的作用。改变培养基中葡萄糖浓度后不影响GHS-R1a mRNA的表达,葡萄糖浓度降低时抑制Ghrelin mRNA的表达,升高时促进Ghrelin mRNA的表达。脂肪细胞在诱导成熟过程中细胞内脂肪的积累增加,抑制Ghrelin mRNA的表达,促进GHS-R1a mRNA的表达。细胞营养供应改变(胎牛血清是否供应),AMPK-2αmRNA、Ghrelin mRNA和GHS-R1a mRNA的表达随之发生显著变化。DEX处理3 h抑制Ghrelin mRNA和GHS-R1a mRNA的表达,处理12 h抑制GHS-R1a mRNA的表达,促进了Ghrelin mRNA的表达。胰岛素抑制Ghrelin mRNA和GHS-R1a mRNA的表达。成肌细胞:Ghrelin(0.7μM)处理不影响成肌细胞的活力。通过检测细胞TG含量和油红染色发现Ghrelin减少了细胞内脂肪的沉积。Ghrelin促进GHS-R1a mRNA和ACC、FAS、CPT1、PPARα等脂肪代谢相关基因mRNA的表达。Ghrelin不影响成肌细胞的线粒体功能,对线粒体有氧呼吸和无氧呼吸没有显著影响,细胞线粒体功能尚待进一步探究。Ghrelin促进了AMPK和ACC蛋白的表达,促进了细胞对脂肪酸的摄取,但抑制了细胞对葡萄糖的摄取,添加AMPK抑制剂Compound C后抑制了Ghrelin诱导的作用。改变培养基中葡萄糖浓度后不影响Ghrelin mRNA和GHS-R1a mRNA的表达。脂肪酸处理增加了细胞内TG的积累,饱和脂肪酸比不饱和脂肪酸更显著的促进了细胞中Ghrelin mRNA的表达,抑制了GHS-R1a mRNA的表达。细胞营养供应改变(胎牛血清是否供应),AMPK-2αmRNA、Ghrelin mRNA和GHS-R1a mRNA的表达随之发生显著变化。DEX处理12 h促进Ghrelin mRNA的表达,在处理24 h内显著抑制GHS-R1a mRNA的表达。胰岛素处理12 h显著抑制Ghrelin mRNA的表达,处理24h显著抑制GHS-R1a mRNA的表达。结果表明:(1)鸡中Ghrelin和GHS-R1a的表达与哺乳动物的类似,广泛地分布于机体组织器官中。(2)Ghrelin对机体能量状态变化敏感,是不同的能量类型而不是能量摄入改变了Ghrelin mRNA和GHS-R1a mRNA的表达。(3)在鸡中Ghrelin既是抑食信号还是促食信号。(4)胰岛素和糖皮质激素是促进Ghrelin分泌的重要调节剂。(5)鸡中Ghrelin调控脂肪代谢不同于哺乳动物,Ghrelin有偏好地选择细胞代谢底物从而影响能量代谢,通过激活AMPK信号通路促进脂肪分解代谢。