Kluyveromyces marxianus GX-15 ADH1基因的克隆、表达及重组蛋白酶学性质研究

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马克思克鲁维酵母(Kluyveromycesmarxianus)具有比其它真核生物更高的生长速率,耐高温性能,以及能利用包括乳糖在内的更广底物范围等,近年来引起人们的注意,被认为是乙醇发酵生产中的优良菌株。酵母乙醇脱氢酶是催化乙醛生成乙醇步骤的关键酶,因此在乙醇发酵代谢中非常重要。酿酒酵母和乳酸克鲁维酵母中乙醇脱氢酶已经有大量的研究,但是对马克思克鲁维酵母乙醇脱氢酶的研究还很少,也还没有对马克思克鲁维酵母乙醇脱氢酶异源表达的研究,对马克思克鲁维酵母乙醇脱氢酶生化性质的研究,将有助于我们进一步认识马克思克鲁维酵母发酵产乙醇的机制。   以KluyveromycesmarxianusGX-15基因组总DNA为模板,通过PCR扩增出乙醇脱氢酶基因(ADH1),与pET-32a(+)表达质粒载体构建重组质粒pET-ADH1,将重组质粒导入E.coliRosseta(DE3)中,在20℃下进行诱导表达20h,经SDS-PAGE电泳分析表明,重组蛋白大小约为57kDa,与预测的结果一致。再经非变性PAGE电泳分析,重组蛋白的大小约为220kDa,预测该蛋白为四聚体。通过酶活检测,该重组乙醇脱氢酶具有较高的活性,其酶活性最适pH为7.0,最适温度为50℃。在最适pH和最适温度下,以乙醇为底物,NAD+为辅酶时重组乙醇脱氢酶的Km值为68.8mM,最大反应速度为48.6μmolmin-1mg-1;以乙醛为底物,NADH为辅酶时,重组乙醇脱氢酶的Km值为4.7mM,最大反应速度为80.3μmolmin-1mg-1。
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