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背景及目的转铁蛋白受体（transferrin receptor,TfR）在正常组织细胞中表达较低,而在肿瘤细胞表面表达增加,是肿瘤细胞相对特异性的分子标志。文献报道及本课题组前期研究证明,肿瘤细胞表面的TfR分子与转铁蛋白的亲和力是正常细胞的10100倍,在迅速扩增的肿瘤细胞表面高表达,其表达水平与肿瘤的分期和预后相关。TfR以其胞外段结合特性、内吞性和与肿瘤细胞作用特点,作为肿瘤靶向显像诊断与靶向治疗的一个重要特异性标志备受关注。然而,在肿瘤的靶向生物治疗中,如何获得特异性靶向效应细胞的抗体是有待解决的关键问题。本课题旨在前期构建抗TfR-scFv和双价表达载体的基础上,进一步设计并通过DNA重组技术,构建并表达抗人TfR和CD3的双特异性抗体（TfR-BiTE）,探索其作用效应及其机制,为其应用于靶向抗肿瘤研究奠定基础。实验方法1.基因扩增与双特异性抗体表达载体的构建以pET-28a-CD3-scFv载体为模板,设计引物,通过分子生物学的方法,从模板上获得目的片段NheI-signal-CD3-scFv-BamHI。通过酶切,连接反应,将目的基因片段插入到pOptiVEC-TfR-scFv-His载体TfR-scFv序列与His标签序列之间,构建Single-TfR-CD3-His双特异性抗体真核表达载体。通过PCR方法,分别从pGM-T-CD3-VH和pGM-T-CD3-VL载体上,获取NotI-CD3-signal-VH-Linker和Linker-CD3-VL-NheI基因。再通过重叠延伸PCR（overlap）技术合成NotI-signal-CD3-VH-Linker-CD3-VL-NheI。分别将其与TfR-（scFv）2-His载体进行NotI/NheI双酶切,最后运用连接酶将两者连接获得表达载体,并命名为Single-CD3-TfR-His通过重叠延伸PCR（overlap）技术,从Single-CD3-TfR-His载体上获得NotI-signal-CD3-VH-G4S-TfR-VL-MluI,再将其放入到pBudCE4.1-IRES-DHFR载体pEF-1a启动子下游,形成并命名为pEF-1a-CD3-VH-TfR-VL载体。运用同样的方法,从Single-TfR-CD3-His载体上获得HindIII-signal-TfR-VH-G4S-CD3-VL-myc-SalI-XbaI基因片段,并放入到pEF-1a-CD3-VH-TfR-VL载体的pCMV启动子下游,形成CD3-TfR-Diabody载体。进一步将IRES-DHFR序列放入到CD3-TfR-Diabody载体上,形成完整地Double-Diabody表达载体。2.TfR-BiTE载体转染、抗体表达与鉴定（1）TfR-BiTE载体转染:通过核转染的方式,将线性化的质粒稳定转染到DHFR-/-的DG44细胞中。应用无血清培养基进行选择培养,待细胞正常扩增后使用甲氨蝶呤（methotrexate,MTX）进行压力筛选,获得阳性稳定表达细胞。运用流式细胞术（FCM）检测细胞培养上清与TfR+肿瘤细胞和CD3+淋巴细胞结合能力,筛选出能够分泌双特异性抗体的多克隆细胞株。最后通过有限稀释和流式鉴定挑选阳性单克隆细胞株;（2）TfR-BiTE抗体的表达:收集稳定表达TfR-BiTE的细胞培养上清,通过镍金属凝胶预装柱,纯化获得TfR-BiTE抗体;（3）TfR-BiTE抗体的鉴定:采用流式细胞术检测TfR-BiTE分别与TfR+肿瘤细胞（HepG2）和CD3+T细胞（PBMCs）的结合。Westernblot检测TfR-BiTE的相对分子量。通过共聚焦显微镜观察TfR-BiTE连接效应细胞和肿瘤细胞。3.TfR-BiTE对PBMCs的刺激作用将未刺激的PBMCs进行CFSE染色后与TfR+肿瘤细胞（HepG2或HT1080）和TfR-BiTE共培养24h（或48h）。采用流式细胞术分别检测TfR-BiTE刺激后的PBMCs（效应T细胞）的活化（CD69+GrB+）与增殖（CFSE的平均荧光强度）。运用流式细胞因子检测技术检测共培养上清中,Th1/Th2细胞因子的分泌水平。4.TfR-BiTE体外抗瘤效应CFSE标记的未刺激的PBMCs与TfR+肿瘤细胞（HepG2/HT1080/HepG2.215/Molt4）和TfR-BiTE共培养24h（或48h）。采用流式细胞术检测肿瘤细胞的杀伤效应（CFSE?7-AAD+）。5.TfR-BiTE体内抗瘤效应NCG小鼠,第0天皮下接种Luc-HepG2细胞,第7天注射新鲜分离的PBMCs,6h后以20mg/mouse的剂量注射TfR-BiTE,连续7天,期间持续监测小鼠肿瘤体积和体重变化。当小鼠肿瘤体积接近2000 mm3时,终止实验,并进行小鼠生物发光活体成像。分离肿瘤并拍照,用IHC分析肿瘤组织中T细胞的浸润,评估TfR-BiTE抗瘤作用效果,并用H&E染色方法分析肝脏组织和肾脏组织的损伤情况。结果1.基因的获取及表达载体的构建以本课题组前期构建的抗TfR-scFv和CD3-scFv相关载体为模板,通过基因工程方法获得TfR-scF和CD3-scFv,并将两者通过不同的方式连接,构建了三种不同结构的双特异性抗体真核表达载体。经克隆/酶切和测序鉴定证明Single-TfR-CD3-His和Single-CD3-TfR-His和Double-Diabody真核表达载体构建成功。2.TfR-BiT的表达与活性鉴定（1）瞬时表达与鉴定:通过瞬时转染293T细胞,获取培养上清,分别与HepG2细胞和PBMCs细胞孵育,鉴定三种结构的双特异性抗体结合活性,其中Single-TfR-CD3-His较好,其次是Double-Diabody,最后是Single-CD3-TfR-His。并且,在介导效应细胞PBMCs杀伤肿瘤细胞HepG2中,两种单链式结构Single-TfR-CD3-His和Single-CD3-TfR-His双特异性抗体比双链式结构Double-Diabody的效果好。（2）稳定表达与鉴定:将两种单链结构式的双特异性抗体,Single-CD3-TfR-His和Single-TfR-CD3-His表达载体分别线性化,转染真核细胞DG44。应用无血清培养基甲氨喋呤（methotrexate,MTX）压力筛选出稳定表达细胞株。稳定转染的细胞培养上清能够很好地与表达TfR的HepG2细胞和表达CD3的T细胞结合,与单抗相似,且Single-TfR-CD3-His的结合比Single-CD3-TfR-His更好。（3）纯化与分子量鉴定:稳定表达的Single-TfR-CD3-His（即TfR-BiTE）细胞培养上清,通过镍金属凝胶预装柱,纯化获得TfR-BiTE抗体。Western blot检测TfR-BiTE的分子量为56 kDa。（4）TfR-BiTE介导靶细胞和效应细胞的连接:共聚焦图像显示,在TfR-BiTE存在的情况下,效应细胞围绕在肿瘤细胞的周围,呈类似于玫瑰花环形状,而对照组没有观察到此现象。3.TfR-BiTE刺激PBMC的活化、增殖及其细胞因子的分泌（1）TfR-BiTE活化T细胞依赖于TfR+肿瘤细胞:当没有靶细胞存在的情况下,TfR-BiTE可以活化T细胞,高表达早期活化标记CD69分子,但是杀伤活性标记GrB的表达仅有约25%。相比之下,当有靶细胞存在的情况下,GrB的表达随着TfR-BiTE浓度的升高而升高,且当TfR-BiTE浓度升高到100 ng/ml时,GrB的表达到达平台期,大约有70%。此外,在CD4+T细胞中,CD69+GrB+细胞仅有30%,而CD8+T细胞中,CD69+GrB+细胞比例高达70%,是CD4+T细胞2倍以上。结果表明,在TfR+肿瘤细胞存在的情况下,TfR-BiTE能使CD3+T细胞活化为具有杀伤功能细胞（CD69+GrB+）,且CD8+T细胞的活化比CD4+T细胞更为显著。（2）TfR-BiTE通过TfR+肿瘤细胞促进T细胞增殖:当TfR+的肿瘤细胞存在时,T细胞亚群的CFSE的平均荧光强度明显降低,且在0.11000 ng/ml浓度范围内,浓度越高,平均荧光强度降低越明显。且在CD8+群中,当TfR-BiTE为1000ng/ml是,添加TfR+肿瘤细胞组CFSE平均荧光强度明显降低,是未添加肿瘤细胞组的3.7倍,是mAb Mix和CD3 mAb组的4.2倍。结果提示,TfR-BiTE能够通过TfR+的肿瘤细胞诱导T细胞的增殖,且在0.11000 ng/ml浓度范围内,浓度越高,增殖越明显。此外,CD8+T细胞的增殖比CD4+T细胞明显。（3）TfR-BiTE刺激PBMCs分泌细胞因子:TfR+肿瘤细胞存在的情况下,当TfR-BiTE浓度为1000 ng/ml时,与mAb Mix组相比,各细胞因子分泌均明显增加,IFN-g增加了（24）（23）（4）、TNF增加了448%、IL-10增加了257%、IL-6增加了1.42%、IL-4增加了329%和IL-2增加了4418%【细胞因子平均增加百分率=（TfR-BiTE1000 ng/ml组-mAb Mix组）/mAb Mix组×100】。结果指示,TfR-BiTE可以通过TfR+肿瘤细胞刺激PBMCs分泌细胞因子,其中IL-2和TNF最为明显,这可能是TfR-BiTE介导效应细胞杀伤肿瘤细胞的一个机制。4.TfR-BiTE介导PBMCs对TfR+肿瘤细胞杀伤的特性（1）TfR分子表达依赖性:在共培养体系中,随着TfR-BiTE浓度的升高,TfR+的肿瘤细胞Luc-HepG2细胞死亡不断增加。然而,在TfR—的MX-1肿瘤细胞中基本没有死亡。结果提示,TfR-BiTE在介导PBMCs杀伤肿瘤细胞时,具有TfR表达的依赖性。（2）TfR分子特异性:在共培养体系中,额外添加了高浓度的TfR mAb或者高浓度的可溶性重组蛋白TfR后,TfR-BiTE对肿瘤细胞的杀伤明显受抑制。结果提示,高浓度的TfR mAb可以与TfR-BiTE竞争性结合肿瘤细胞表面的TfR,从而抑制TfR-BiTE介导的杀伤肿瘤细胞的作用。相同地,高浓度的可溶性重组TfR蛋白可以中和部分的TfR-BiTE,使其有效浓度降低,从而降低了对肿瘤细胞的杀伤。（3）TfR分子丰度相关性:Molt4、HepG2、HT1080和HepG2.215,4株肿瘤细胞的TfR表达丰度逐渐降低,TfR-BiTE介导的杀伤效应也逐渐降低。这一结果提示,TfR-BiTE介导PBMCs杀伤肿瘤细胞与TfR分子丰度呈正相关。此外,不同来源的PBMCs对同一株肿瘤细胞的杀伤也不尽相同。5.体内TfR-BiTE对肿瘤的抑制作用NCG小鼠皮下接种Luc-HepG2细胞,第7天注射PBMCs和TfR-BiTE,连续7天注射TfR-BiTE,当小鼠肿瘤体积接近2000 mm3时,终止实验。小鼠的肿瘤体积显示,注射了TfR-BiTE组的NCG小鼠肿瘤体积明显小于对照组。进一步肿瘤免疫组织化学（IHC）分析结果显示,TfR-BiTE组的肿瘤组织中,有明显的CD3+淋巴细胞浸润,而对照度没有观察到浸润的淋巴细胞。同时,各实验组小鼠的体重没有差异,小鼠肝组织和肾组织的H&E染色结果也未观察到明显的损伤。以上结果提示TfR-BiTE可以募集T细胞到肿瘤局部,发挥抗肿瘤作用,并且没有肝脏和肾脏的明显损伤作用。结论本课题实验结果表明:（1）成功构建新型抗TfR×CD3双特异性抗体TfR-BiTE真核表达载体,并实现了在真核细胞中稳定表达;（2）TfR-BiTE能够分别与TfR+肿瘤细胞和CD3+淋巴细胞结合,介导两者的连接,为肿瘤细胞杀伤提供理论基础;（3）在TfR+细胞存在的条件下,TfR-BiTE能促进CD3+T细胞活化和增殖,且CD8+T细胞的活化和增殖均比CD4+T细胞更为显著;（4）与CD3 mAb相比,TfR-BiTE活化T细胞表现出更高的Granzyme B的表达和细胞因子的表达能力,其中,IL-2和TNF表达量显著增加;（5）TfR-BiTE能够介导CD3+T细胞杀伤TfR+的肿瘤细胞,且具有TfR表达的依赖性、特异性和丰度相关性的特征。同时,在0.1 ng/ml1000ng/ml的浓度范围内,杀伤效应具有TfR-BiTE浓度依赖性;（6）在Luc-HepG2肿瘤细胞异种移植动物模型中,TfR-BiTE可以募集CD3+T细胞到肿瘤组织,抑制肿瘤的生长,并且没有观察到代谢器官肝脏和肾脏有明显损伤。综上结果表明,本课题所构建的TfR-BiTE为其应用于靶向抗肿瘤研究奠定了良好的基础。