结核病（Tuberculosis,TB）是由结核分枝杆菌复合群（Mycobacterium tuberculosis complex,MTBC）感染引起的慢性消耗性人兽共患传染病,严重影响着人类和动物的健康,是全球面临的重大公共卫生问题之一。尽管卡介苗疫苗挽救了数以千万计的生命,但未能显著的控制TB的发生,这主要是因为到目前为止,尚未完全阐明结核分枝杆菌（M.tb）的感染致病机制,进而影响了有效药物和疫苗的开发,使得目前TB仍然是人类和动物健康的重大威胁。研究表明,在M tb经呼吸道进入肺脏的感染过程中,肺泡巨噬细胞（AM）是首先被感染的靶细胞,且AM对感染的先天免疫应答是引起获得性免疫应答和有效控制M.tb感染的首要步骤,M.tb和AM感染的早期对抗结果决定了 TB的进一步发生发展。因此,探究AM对M.tb感染的早期免疫反应事件,即自噬的发生、自噬与炎性反应之间的相互作用以及M.tb与AM间的脂质代谢的相互调控,将有助于深入理解宿主AM清除M.tb的分子机制。2019年陈志坚团队首次在《Nature》上报道了 cGAS-STING通路的激活并“诱导自噬”的功能,即与细胞质中微生物或自身DNA结合来检测感染或组织损伤,并强调了 cGAMP诱导的自噬对细胞质中DNA和病原清除的重要性,这提示我们“cGAS-STING信号是否也在M.tb感染AM的早期与传统TLRs信号通路进行互作,通过协同调控自噬和炎性反应来对抗M tb的感染?”。我国学者最近发现,LncRNAMALAT1在活动性TB患者的外周血中高表达,可能是辅助诊断结核活动性感染的生物标志物;并且发现H37Rv感染巨噬细胞可促进MALAT1表达上调,沉默MALAT1可增强巨噬细胞对H37Rv的清除能力。Bhatt Bharat（2020）发现在M.tb感染中MALAT1参与调节了巨噬细胞富含脂质的环境,这有利于分枝杆菌的生长。据此,我们推测MALAT1在M.tb感染有可能通过介导巨噬细胞早期的自噬等参与调控M.tb的感染过程。因此,我们结合有关cGAS-STING信号通路和LncRNA MALAT1在自噬中的最新进展,探讨了 cGAS-STING信号通路及MALAT1在M.tb H37Ra感染巨噬细胞RAW264.7的早期是如何调控巨噬细胞自噬,以及二者之间的“cross-talk”互作关系;在此基础上,我们进一步分离牛原代肺泡巨噬细胞（BAM）,建立人型和牛型分枝杆菌临床株的BAM早期感染模型,通过全转录组学和脂质组学测序和生物信息分析,深入解析了不同临床型分枝杆菌感染早期事件的差异,以期为深入理解M.tb的致病机制和防治提供理论参考。通过研究,我们主要取得了以下结果:1.cGAS信号在M.tb感染巨噬细胞中对cGAS-STING信号通路、自噬和TLR信号通路的调控作用:通过对RAW264.7细胞cGAS基因的干扰/过表达后的Western-blot分析发现,cGAS-STING信号通路中的TBK1、p-TBK1、IRF3、p-IRF3、STING和p-STING,以及自噬相关蛋白ATG5、Beclin、LC3Ⅱ和p62的表达与cGAS呈正相关;cGAS在H37Ra早期感染的巨噬细胞中激活了 p-STING、p-TBK1和p-IRF3的表达,下调STING、TBK1和IRF3的表达,进而介导了自噬相关蛋白ATG5、Beclin、LC3Ⅱ和p62的活化。利用mRFP-GFP-LC3自噬双标腺病毒对RAW264.7的M tb感染细胞模型的自噬流和自噬通量分析结果也进一步验证了这一现象,这些结果表明,cGAS可促进cGAS-STING信号通路介导的H37Ra诱导的巨噬细胞自噬。在H37Ra感染cGAS干扰/过表达巨噬细胞中对TLR信号通路的Western-blot和ELISA分析发现,cGAS正调控TLR信号通路的相关蛋白TLR-6、TRAF6、NF-κB p65、p-NF-κB p65和MYD88的表达,以及下游炎症因子IL-1β、IL-6和TNFα的表达。这说明cGAS在H37Ra感染巨噬细胞中正向介导了 TLR信号通路的活化和炎性细胞因子的分泌。2.STING信号在M.tb感染巨噬细胞中对cGAS-STING信号通路、自噬和TLR信号通路的调控作用研究:通过对RAW264.7细胞中STING基因的干扰/过表达后的Western-blot分析发现,cGAS-STING信号通路中的cGAS、TBK1、p-TBK1、IRF3、p-IRF3和p-STING,以及自噬相关蛋白ATG5、Beclin、LC3Ⅱ和p62的表达与STING呈正相关;通过对H37Ra感染前后的干扰/过表达STING的RAW264.7细胞的Western-blot分析发现,STING信号下调TBK1和IRF3的表达,活化cGAS、p-STING、p-TBK1和p-IRF3的表达,进而活化了自噬相关蛋白ATG5、Beclin、p62和LC3Ⅱ的表达;并进一步得到了 mRFP-GFP-LC3自噬双标腺病毒对自噬流和自噬通量的分析验证。这些结果证明,STING促进了 cGAS-STING信号通路介导的H37Ra感染巨噬细胞的自噬调控。通过进一步对感染细胞模型中TLR信号通路的Western-blot和ELISA分析发现,STING信号正调控TLR信号通路的中TLR-6、NF-κB、p-NF-κB p65和MYD88的表达,并介导了炎症因子IL-1β、IL-6和TNFα的分泌;STING在H37Ra感染巨噬细胞中促进了 TLR信号通路的活化和炎性细胞因子的分泌。3.LncRNA MALAT1在M.tb感染巨噬细胞中对cGAS-STING信号通路的互作,以及对自噬和TLR信号通路的调控作用研究:在H37Ra感染巨噬细胞RAW264.7后,通过Realtime-qPCR分析发现MALAT1在感染后表达量上调;对干扰MALAT1前后的RAW264.7感染细胞模型进行Realtime-qPCR和Western-blot分析发现,MALAT1正调控cGAS-STING信号通路中的cGAS、p-STING、p-TBK1和p-IRF3的表达,下调了STING、TBK1和IRF3的表达,进而介导自噬相关蛋白ATG5、Beclin、p62和LC3Ⅱ的活化,并进一步利用mRFP-GFP-LC3自噬双标腺病毒对自噬流和自噬通量进行了分析验证。在干扰MALAT1后,通过Western-blot和ELISA分析发现TLR信号通路中的TLR6、TRAF6、MYD88、NF-κB p65和p-NF-κB p65蛋白表达量显著下调,炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α和IFN-β的分泌量下降;在H37Ra感染RAW264.7后活化了TLR信号通路和炎症因子的分泌。进一步通过对H37Ra感染前后cGAS和STING的干扰株/过表达RAW264.7细胞中MALAT1的表达量分析发现,cGAS、STING与MALAT1的表达呈正相关。4.牛型和人型分枝杆菌临床株感染牛原代肺泡巨噬细胞（BAM）的全转录组学分析:我们分别构建了 3株结核分枝杆菌（M.tb）和3株牛分枝杆菌（M bovis）临床株感染牛原代肺泡巨噬细胞（BAM）4h和6h的cDNA文库,并进行全转录组测序和生物信息学分析,结果发现:（1）M.tb的感染引起了 BAM中194个基因的上调和138个基因的下调,103个LncRNA的上调和111个LncRNA的下调;对M.tb与对照组（CK）比较得到的332个差异表达基因进行了GO富集分析表明,有25个基因与免疫系统和信号转导功能相关,参与了脂质代谢、免疫反应、炎症反应和信号转导。（2）M.bovis的感染引起了 BAM.中235基因的上调和135个基因的下调,119个LncRNA的上调和99个LncRNA的下调;在M.bovis vs.CK中获得的370个差异基因中,与M.tb感染相比,M.bovis在BAM.中触发了更多与免疫信号通路、趋化因子和炎症细胞因子相关的21个基因的表达活化;而M.bovis没有引发营养代谢相关通路的显著变化。（3）通过对转录组中cGAS-STING、自噬和TLR信号通路相关基因的mRM.A差异表达富集分析发现,M.tb和M.bovis感染BAM.引起了巨噬细胞中相关基因的表达变化,TLR6、TRAF6、cGAS和ATG5感染后的表达量均发生上调,IRF3和TBK1的表达量下调。（4）通过构建关键基因WGCNA,选择了11927个LncRNA和miRNA进行进一步分析,通过层次聚类识别了19个差异基因。对与M.tb感染有关的PCK1、PTGS2和CNTNAP1,以及与M.bovis和M.tb相关的CXCL3和RAG2基因作为候选基因,分别构建了M.tb-BAM和M.bovis-BAM的基因共表达互作网络,确定PTGS2是参与M.tb-BAM互作关键基因,与bta-miR-574、bta-miR-29b、bta-miR-15a、bta-miR-9-5p、bta-miR-30a-5p和66个LncRNA呈负相关,与38个LncRNA呈正相关。M.tb可以上调bta-miR-574和bta-miR-9-5p的表达。KEGG通路富集分析结果表明,参与M.tb-BAM.相互作用网络的基因主要参与了与营养代谢相关脂肪消化和吸收,以及各种氨基酸代谢的途径。CCL20是参与M.bovis-BAM.相互作用调控网络的关键基因,与bta-miR-7857-5p和16个LncRNA呈负相关,与4个LncRNA呈正相关。与关键基因相关的LncRNA中,各种LncRNA的表达在早期相互作用阶段受到M.bovis或M.tb感染的显著影响。KEGG通路富集分析结果表明,参与M.tovis-BAM相互作用的基因则主要在包括MAPK信号通路以及TNF信号通路、鞘脂信号通路、p53信号通路等与免疫相关通路中发挥作用。上述结果提示,M.tb可能激活BAM.免疫反应的同时影响宿主营养代谢以进行定植和复制;而M.bovis被宿主识别,导致免疫系统激活以防御其入侵。5.M.tb和M.bovis临床株感染BAM的双脂质组学分析:我们进一步分别使用3株临床株M.tb和3株M.bovis感染BAM.4h和6h后进行了细菌和宿主细胞内的双脂质组学分析,结果发现:（1）细菌脂质组分析:在M.tb中,17种脂质的水平含量较高,其中5种为M.tb脂质代谢的关键脂质。在M.bovis中,45种脂质含量较高,5种为M.bovis脂质代谢的关键脂质。与M.tb相比,M.bovis中聚酮、鞘脂和脂质以及类脂分子含量更高。由此,我们得出结论,M.tb和M.bovis的脂质成分显著不同。（2）宿主细胞脂质组分析:在M.tb感染的BAM中有37种脂质增加,通过脂质分类富集分析发现聚酮和甘油磷脂极显著增加（P＜0.0001）。M.bovis感染的BAM中,49种脂质高度积累,其中18种属于甘油磷脂。因此,M.tb和M.bovis的感染导致BAM的脂质代谢存在明显差异。进一步利用筛选出的M.tb和M.bovis的62种脂质,以及M.tb和M.bovis感染巨噬细胞中的86种脂质构建了脂质网络,通过分析发现,有1种M.tb和4种M.bovis的脂质引起了巨噬细胞响应分枝杆菌感染后的脂质代谢的差异。