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目的:本实验拟:1、建立一种简便易行的体外制备人工关节金属磨损颗粒的方法;2、研究在RANKL(核因子κB受体活化因子配基)诱导下小鼠单核巨噬细胞RAW264.7形成破骨细胞的方法。3、观察不同浓度金属磨损颗粒对RAW264.7RANK、TRAP表达的影响及在RANKL诱导下形成破骨细胞数量变化。以期进一步阐明人工关节假体松动过程中的生物学机制。方法:1、采用真空球磨法体外制备人工关节金属磨损颗粒,用显色基质鲎试剂盒检测颗粒悬液样本内毒素含量,等离子体发射光谱法对磨损颗粒进行元素分析,扫描电镜观察磨损颗粒形态,激光粒度仪检测磨损颗粒直径,通过检测不同浓度颗粒混悬液(0.1mg/ ml,1.0 mg/ ml,10 mg/ ml)作用于RAW264.7的上清液的乳酸脱氢酶来评价磨损颗粒的细胞毒性;2、抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色法及扫描电镜检测骨吸收陷窝鉴定诱导的破骨细胞;3、将不同浓度磨损颗粒混悬液(0.5mg/ ml,1.0 mg/ ml,1.5 mg/ ml)作用于RAW264.7,用RT-PCR法检测RANK、TRAPmRNA的表达,用RANKL诱导后,再行TRAP染色,倒置显微镜下计数破骨细胞数量。结果:1、真空球磨法制备的颗粒与其原料的元素组成基本相同,颗粒直径<5μm,与体内分离的人工关节金属磨损颗粒理化性质一致,在试验浓度(通常远低于10 mg/ml)没有显示细胞毒性。2、RAW264.7诱导形成的破骨细胞在培养7天后细胞数量达峰值,破骨细胞胞体较大,呈不规则,边缘不整齐,周围有刷状缘及伪足,多核;TRAP染色阳性,有骨吸收功能,具有成熟破骨细胞特征。3、不同浓度磨损颗粒作用于RAW264.7 7d后,显微镜下计数破骨细胞数量,结果显示随着磨损颗粒混悬液浓度增加,RANKL诱导生成的破骨细胞增多,低、中、高浓度三组破骨细胞数均显著高于空白对照组(P<0.05),中、高浓度组破骨细胞数均显著高于低浓组(P<0.05),高浓度组破骨细胞数亦显著高于中浓组(P<0.05)。4、随着磨损颗粒混悬液浓度增加,RANKmRNA表达逐渐增加,低、中、高浓度三组RANKmRNA表达均显著高于对照组(P<0.05),中、高浓度组RANKmRNA表达均显著高于低浓组(P<0.05),高浓度组RANKmRNA表达亦显著高于中浓组(P<0.05)。5、随着磨损颗粒混悬液浓度增加,TRAPmRNA表达有所增加,低、中、高浓度三组RANKmRNA表达均显著高于对照组(P<0.05),但低、中、高浓度三组RANKmRNA表达无显著性差异(P>0.05)。结论:1、真空球磨法体外制备人工关节金属磨损颗粒简便易行,重复性好,可以用于相关的细胞学研究。2、RAW264.7是一种较好的破骨前体细胞模型,RAW264.7诱导形成破骨细胞的方法简便易行,所获得破骨细胞均一性好。3、金属磨损颗粒对单核吞噬细胞的RANK及TRAP表达的调控是发生在基因水平。RANK及TRAP表达的增加可能为RAW264.7细胞向具有骨质吸收功能的破骨细胞转化发挥正向作用。