目的:本课题以治疗带状疱疹后遗神经痛(PHN)临床验方为研究对象,在前期药效学试验研究的基础上,针对处方中虫类药物所含蛋白多肽类有效成分,开展提取工艺研究;根据临床应用特点,将其制成片剂,克服原粉末服用存在的异味大及用量大等缺点,对元全片进行规范的制备工艺、质量标准、主要药效学和镇痛作用机制等系列研究,并初步阐明其镇痛作用机制,为开发治疗PHN的中药新药奠定基础。方法:1.神经病理性疼痛模型的建立。(1)建立兴奋毒性脊髓损伤大鼠模型,考察致痛物质NMDA浓度对大鼠缩足阈值的影响;(2)建立脊神经选择结扎大鼠模型。2.元全片制备工艺研究。(1)采用兴奋毒性脊髓损伤大鼠模型,通过比较四种提取工艺样品镇痛药效,优选最佳提取方法;(2)以蛋白多肽类成分含量作为评价指标,通过单因素考察和正交试验优化金边土鳖、全蝎匀浆提取工艺;采用高压平板膜对金边土鳖、全蝎匀浆提取液进行膜分离和浓缩工艺研究;(3)以芍药苷、甘草苷含量及固形物质量作为评价指标,通过单因素考察和正交试验优化白芍、甘草水提取工艺;以芍药苷保留率作为评价指标,对提取液进行浓缩方法的考察及干燥工艺的研究;(4)采用兴奋毒性脊髓损伤大鼠模型对全方浸膏粉进行量效关系考察,评价其剂量-效应关系;(5)对全方浸膏粉进行处方前研究:包括吸湿速率、临界相对湿度的测定,粉体学性质的考察等,评价浸膏粉的吸湿性、流动性及可压性;(6)考察浸膏粉碎粒度和混合时间对粉体学的影响;以片剂崩解时限、重量差异、脆碎度及片面外观为评价指标,考察元全片处方及成型工艺,筛选崩解剂、润滑剂等辅料种类和用量;以崩解时限和引湿性为评价指标,对片芯薄膜包衣工艺进行考察;采用高湿试验法,比较不同包装材料对片剂吸湿增重、崩解时限、片面外观的影响,优选片剂包装材料。(7)进行三批中试验证试验,评价元全片制备工艺的稳定性与可行性。3.元全片质量标准研究。按照中药新药研究技术指导原则有关要求,建立元全片质量标准。4.元全片主要药效学研究。采用兴奋毒性脊髓损伤大鼠模型、脊神经选择结扎大鼠模型,给予不同剂量元全片,观察给药前后大鼠术侧后肢足底缩足阈值的变化情况,并与临床常用治疗PHN的药物比较,评价元全片的镇痛作用效果。5.元全片镇痛作用机制研究。(1)采用膜分离技术,对君药金边土鳖匀浆提取液进行分离,通过兴奋毒性脊髓损伤大鼠模型,筛选金边土鳖镇痛活性部位;(2)采用ELISA法检测兴奋毒性脊髓损伤模型和脊神经选择结扎模型SD大鼠造模后及给药后血清中IL-1β、NGF水平变化,RT-qPCR检测其脊髓GFAP、IL-1β、Navl.8、NGF mRNA表达变化,免疫组织化学方法检测其脊髓背角中GFAP、NR1、GLT-1表达变化,初步探讨君药金边土鳖及元全片的镇痛作用机制。结果:1.复制了兴奋毒性脊髓损伤大鼠模型和脊神经选择结扎大鼠模型,致痛物质NMDA造模浓度为0.5 g/L,两种模型所致大鼠神经病理性疼痛均可持续2周以上。2.金边土鳖、全蝎最佳匀浆提取及膜分离浓缩工艺:按处方比例,称取金边土鳖、全蝎粗粉,加入4倍量0.9%NaCl溶液高速匀浆(10000 r/min),反复3次,每次60 s,间隔暂停10 s,再加入6倍量0.9%NaCl溶液,用恒温振荡器(120 r/min)震荡提取1 h,5000 r/min离心15 min后收集上清液,药渣重复上述工艺,连续提取3次,合并上清液备用;将匀浆提取液在1～2 MPa操作压力下,采用截留Mr为50 kDaI的超滤膜进行分离,收集膜分离液,在4 MPa操作压力下通过截留Mr 200 Dal的纳滤膜进行浓缩,收集膜浓缩液,冷冻干燥得冻干品。膜分离浓缩过程蛋白多肽类成分总保留率为86.23%±0.69%,冻干品纯度为 56.17%士0.46%。3.白芍、甘草最佳水提取及浓缩干燥工艺:按处方比例,称取白芍、甘草药材,加10倍量水提取2次,每次提取2 h,滤过,合并提取液,采用减压浓缩(-0.085 Mpa;75～85℃),真空干燥(-0.085 Mpa,50～70℃)。白芍、甘草水提取过程干膏得率为17.88%±0.36%,芍药苷提取率为59.32%士0.37%,甘草苷提取率为51.88%±1.03%。4.成型工艺:控制实验环境相对湿度在60%以下,将金边土鳖、全蝎冻干粉和白芍、甘草浸膏粉过65目筛,混合15 min,得全方浸膏粉;采用粉末直接压片法,加入0.5%硬脂酸镁和1.5%滑石粉作为润滑剂,压制成硬度为5～7 kgf、片重为0.49 g的浅凹形(?)11 mm片芯;采用薄膜包衣预混剂对片芯进行包衣,包衣增重至7%～9%;选用高密度聚乙烯瓶或经泡罩分装后的成品再选用包装材料PET/AL/PE结构的药用复合膜封装,即得元全片(0.53 g/片,口服,3片/次,每日3次)。5.质量标准:建立了方中金边土鳖、白芍、甘草3味药材的薄层色谱鉴别方法及芍药苷、甘草苷、甘草酸和氮含量的检测方法和最低含量限度,暂定本品每片含白芍以芍药苷计,不得少于5.56 mg:含甘草以甘草苷、甘草酸计,分别不得少于0.47 mg、4.75 mg;含总氮(N)不得少于11.5 mg;进行了元全片的外观性状、重量差异和崩解时限检查。6.药效学研究结果:在两种神经病理性疼痛大鼠模型上,元全片高、中、低剂量均有不同程度地增加大鼠术侧足底缩足阈值,即减轻大鼠神经痛的作用,元全片给药剂量为临床常用量:日服用生药量28g,0.53g/片,每次3片,一日3次,疗程7d。7.镇痛作用机制研究结果:金边土鳖200～5000 Dal分子量段及元全片给药后,可明显降低兴奋毒性脊髓损伤模型大鼠血清IL-1β、NGF水平,抑制脊髓GFAP、IL-1β、Nav1.8、NGF mRNA及脊髓背角中GFAP和NR1免疫组化阳性产物表达,促进脊髓背角中GLT-1免疫组化阳性产物表达;同样可明显降低脊神经选择结扎模型大鼠血清IL-1β水平,抑制脊髓GFAP和IL-1β mRNA及脊髓背角中GFAP和NR1免疫组化阳性产物表达,促进脊髓背角中GLT-1免疫组化阳性产物表达,但对大鼠血清NGF水平以及脊髓Nav1.8和NGF mRNA表达无明显差异。结论:元全片的制备工艺、质量标准、主要药效学研究结果表明,元全片的制备工艺稳定、合理可行,药效明确且质量可控;镇痛作用机制结果表明,方中君药金边土鳖200～5000 Da1分子量段及元全片可能是通过调控钠离子通道Nav1.8、抑制脊髓背角NR1及星形胶质细胞GFAP的表达,促进星形胶质细胞膜上GLT-1的表达上调,调节炎症因子及细胞因子的释放,从而减轻大鼠经兴奋毒性脊髓损伤和脊神经选择结扎导致中枢敏化而引起的痛觉过敏。研究结论为下一步开发作用机制明确的治疗PHN的有效中药奠定了基础。