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目的：
全球丙型肝炎病毒(Hepatitis C vims，HCV)感染者约2亿人，我国属于高流行地区。HCV感染者中，约30％可以自发清除病毒，70％转为慢性感染，其中10％-20％进而发展为肝硬化、肝功能衰竭或原发性肝细胞癌(HCC)。HCV感染诊断通常采用ELISA检测病毒抗体，PCR检测病毒RNA或两种方法同时进行。目前，单试剂盒ELISA检测HCV抗体“阳性”结果中，约1/3为假阳性、1/3抗体阳性而病毒RNA阴性(HCV Ab+/RNA-)、1/3为抗体与RNA双阳性(HCV Ab+/RNA+)。临床上除检测HCV抗体与RNA外，鉴于HCV核心蛋白抗原(HCVcAg)全程伴随着病毒复制，己成为确诊HCV窗口期及慢性感染的重要检测指标。当前，国际和国内市场上，HCVcAg检测方法与试剂盒稀缺，其生产厂家国外只有Onho和Abbott两家，国内只有湖南康润和山东莱博两家，但检测灵敏性以及亚型覆盖面普遍不够理想。因此，HCVcAg检测仍是一项国际性技术难题。限制HCVcAg检测技术突破的根本原因在于缺乏对HCVcAg表位的详尽研究与了解，缺少高亲和力及特异性识别HCVcAg不同表位的单克隆抗体(mAb)以及具有实际应用价值的高灵敏检测技术或方法。本博士学位论文针对现行HCV临床检测方法中存在的关键材料与技术缺陷，对HCVcAg表位进行深入系统地分析，研制出可用于多个HCVcAg表位检测的单克隆抗体，填补国内外检测HCVcAg的关键单克隆抗体试剂的缺失，建立适用于血液安全筛查及临床诊断的HCVcAg多表位的高灵敏、高特异性免疫学检测方法。
方法：
本研究对HCVcAg蛋白的抗原表位进行系统分析，选取保守肽段免疫小鼠测定其免疫原性。采用杂交瘤融合技术制备鼠源单克隆抗体，发现和验证天然HCVcAg的多个表位。采用筛选的配对高亲和力单克隆抗体与可控信号放大系统，结合稀土铕荧光纳米颗粒(Eu+3nanopanicles，EuNPs)或纳米金颗粒(gold nanoparticles，AuNPs或GNPs)，建立快速检测HCVcAg的高灵敏免疫层析检测方法或固相免疫测定方法。
结果：
1、HCVcAg抗原表位
经对HCV核心蛋白氨基酸序列分析，选取了HCVcAg的21-40aa、41-60aa、51-70aa、101-120aa、121-140aa五个保守氨基酸序列。利用这5个合成多肽免疫小鼠，成功制备与鉴定出可识别相应肽段(51.70aa没有诱导小鼠产生抗体，未能制备出相应的抗体)的57株单克隆抗体(mAbs)，并证实这些肽段的抗体结合位点为天然HCVcAg抗原表位。在57株mAbs中，46株mAbs可识别41-60aa、101-120aa及121-140aa多肽，揭示了3个新的HCVcAg抗原表位，在国际上尚属首次发现。研究还发现21-40aa、41-60aa、101-120aa三段多肽表位可以诱导动物产生高亲和力的抗体，更正了HCVcAg只有21-40aa一个抗原表位的认知，为采用双抗体夹心法检测HCVcAg提供了理论依据与关键试剂。
2、高灵敏可控信号放大系统
以往报道的的信号放大系统多是不可控的体系，一旦反应其信号就增强到最大，不能区分特异结合与非特异结合，从而出现严重的假阳性反应信号。本研究发明了两种用于免疫检测的可控信号放大系统(Controlled signal amplification system，Controlled-SAS)，其特征如下:
(1)免疫层析检测可控信号放大系统。该系统由纳米颗粒如EuNPs或AuNPs标记的靶抗原检测抗体、生物素标记的靶抗原捕获抗体和位于固相上的抗生物素抗体组成。样本中的靶抗原分子会与生物素标记的捕获抗体和纳米颗粒标记的检测抗体形成树枝状的免疫复合物，并被固相上的抗生物素抗体捕获，从而实现对靶抗原分子的高灵敏高特异性检测。纳米颗粒介导的检测信号被显著放大并与检测靶抗原浓度呈正相关。只有在靶抗原存在的情况下，信号放大系统方起作用。本研究基于免疫层析法(LFIA)的可控信号放大系统(Controlled-SAS)，证实检测血浆样品乙肝e抗原(HBeAg)的敏感性增加了9倍，为高灵敏检测类似抗原分子HCVcAg提供了参考。
(2)免疫固相检测可控信号放大系统。该系统由抗生物素抗体和辣根过氧化物酶(HRP)双分子修饰的纳米颗粒(如AuNPs)、生物素标记的靶抗原检测抗体和位于固相上的靶抗原捕获抗体组成。样本中的靶抗原分子与固相上的捕获抗体及生物素化的检测抗体结合，进而与纳米颗粒上的抗生物素抗体结合，间接实现纳米颗粒上的HRP对靶抗原的标记，催化底物显色指示靶抗原的存在。该可控信号放大系统解决了亲和素非特异反应的问题，与常规ELISA方法比较具有更高的灵敏性。
3、高灵敏可控信号放大系统免疫检测HCVcAg方法
(1)可控信号放大系统免疫层析荧光试纸条(Controlled-SAS LFIA)检测HCVcAg:以LFIA为基础，建立了一种高灵敏、高特异的HCVcAg免疫试纸条检测法。所制备的试纸条由样品垫、结合垫、硝酸纤维素(NC)膜、吸水纸及PVC底板组成。临床样品在检测前，首先对血浆或血清样本进行变性处理，然后再将生物素化捕获抗体和EuNPs标记的检测抗体添加到变性处理后的样品液中，对其中的HCVcAg进行充分捕获。将纳米颗粒标记的抗原-抗体复合物离心分离，然后再采用免疫层析法对该免疫复合物悬液进行检测。该方法检测HCVcAg的敏感性相当于qPCR检出HCV RNA105IU/mL的血浆样本。通过对41份献血者HCV RNA阳性血浆样本检测比较，该Controlled-SAS LFIA与商品化ELISA试剂盒对HCVcAg的检出率分别为53.7％与56.1％，差异不显著(P＞0.5)。结果表明，本研究建立的高灵敏免疫层析试纸条与常规ELISA方法的敏感性和检出率相同，且具有简便快速的优点，在丙型肝炎特异性快速诊断中具有较高实际应用价值。
(2)可控信号放大系统ELISA(Controlled-SAS ELISA)检测HcVcAg:
采用HCVcAg捕获单抗包被微孔板，与生物素化的检测抗体夹心检测血浆中HCVcAg靶抗原，最后通过抗生物素抗体和HRP双分子标记的AuNPs的可控信号放大系统，以HRP催化底物显色指示反应结果。实验针对血浆中HCVcA2多以免疫复合物形式存在的问题，研究确立了含5.5M尿素、5％Tween80、1％Triton X-100的样品处理液。经各环节及相关要素条件优化，研究建立了基于可控信号放大系统的新型AuNPs-SAS ELISA方法，用于79份HCV RNA阳性献血者血浆样品HCVcAg检测。与常规ELISA比较，Controlled-SAS ELISA反应敏感性提高了10倍，其检测HCVcAg阳性结果与HCv RNA阳性样品符合率为91.1％，而常规ELISA的检测符合率为55.7％，两种方法检出率差异非常显著(P＜0.01)。建立的可控AuNPs-ELISA方法克服了现行ELISA诊断方法的灵敏性低的技术缺陷，可用于献血者HCV感染筛查及临床诊断。
结论：
1、研究制备了HCV核心蛋白21-40aa、41-60aa、101-120aa、121-140aa多肽单克隆抗体，发现并证实这些肽段含HCVcAg抗原表位，可作为免疫诊断试剂检测的靶标，为HCVcAg检测产品的研发提供了理论依据和关键抗体试剂。
2、研究发明了一种新型的可控信号放大方法系统和一种双分子标记纳米颗粒的可控信号放大系统。这两个系统可以显著提高免疫学检测方法的灵敏性而不降低特异性，可应用于免疫层析检测试纸条或固相免疫检测方法。
3、研究选用制备的可识别HCVcAg多表位的单克隆抗体或多表位免疫血清抗体的夹心技术，建立了检测血浆或血清中HCVcAg靶抗原的高灵敏可控信号放大系统荧光试纸条及ELISA方法，可用于HCV感染献血者筛查及临床诊断。
创新性和意义:
(1)本研究在国际上首次系统分析与揭示了HCVcAg抗原表位。除己报道的21-40aa表位外，新发现了HCVcAg41-60aa、101-120aa、121-140aa肽段可以诱导产生特异性抗体，证实这三个多肽位点是HCVcAg的抗原表位，可作为免疫诊断的检测靶标。
(2)采用HCV核心蛋白21-40aa、41-60aa、101-120aa三个表位多肽表位免疫动物制备了一批高亲和力单克隆抗体，为研制双抗体夹心法检测HCVcAg诊断试剂盒的提供了关键材料。
(3)发明的高灵敏可控信号放大系统在保证特异性的同时，大幅度提高了免疫检测HCVcAg靶抗原的灵敏性，具有代替现有双抗体夹心免疫层析方法或ELISA的潜在应用前景。
(4)建立的高灵敏可控信号放大HCVcAg免疫检测方法，为其他类似靶抗原分子(诸如HBeAg等)免疫检测提供了重要参考依据。
全球丙型肝炎病毒(Hepatitis C vims，HCV)感染者约2亿人，我国属于高流行地区。HCV感染者中，约30％可以自发清除病毒，70％转为慢性感染，其中10％-20％进而发展为肝硬化、肝功能衰竭或原发性肝细胞癌(HCC)。HCV感染诊断通常采用ELISA检测病毒抗体，PCR检测病毒RNA或两种方法同时进行。目前，单试剂盒ELISA检测HCV抗体“阳性”结果中，约1/3为假阳性、1/3抗体阳性而病毒RNA阴性(HCV Ab+/RNA-)、1/3为抗体与RNA双阳性(HCV Ab+/RNA+)。临床上除检测HCV抗体与RNA外，鉴于HCV核心蛋白抗原(HCVcAg)全程伴随着病毒复制，己成为确诊HCV窗口期及慢性感染的重要检测指标。当前，国际和国内市场上，HCVcAg检测方法与试剂盒稀缺，其生产厂家国外只有Onho和Abbott两家，国内只有湖南康润和山东莱博两家，但检测灵敏性以及亚型覆盖面普遍不够理想。因此，HCVcAg检测仍是一项国际性技术难题。限制HCVcAg检测技术突破的根本原因在于缺乏对HCVcAg表位的详尽研究与了解，缺少高亲和力及特异性识别HCVcAg不同表位的单克隆抗体(mAb)以及具有实际应用价值的高灵敏检测技术或方法。本博士学位论文针对现行HCV临床检测方法中存在的关键材料与技术缺陷，对HCVcAg表位进行深入系统地分析，研制出可用于多个HCVcAg表位检测的单克隆抗体，填补国内外检测HCVcAg的关键单克隆抗体试剂的缺失，建立适用于血液安全筛查及临床诊断的HCVcAg多表位的高灵敏、高特异性免疫学检测方法。
方法：
本研究对HCVcAg蛋白的抗原表位进行系统分析，选取保守肽段免疫小鼠测定其免疫原性。采用杂交瘤融合技术制备鼠源单克隆抗体，发现和验证天然HCVcAg的多个表位。采用筛选的配对高亲和力单克隆抗体与可控信号放大系统，结合稀土铕荧光纳米颗粒(Eu+3nanopanicles，EuNPs)或纳米金颗粒(gold nanoparticles，AuNPs或GNPs)，建立快速检测HCVcAg的高灵敏免疫层析检测方法或固相免疫测定方法。
结果：
1、HCVcAg抗原表位
经对HCV核心蛋白氨基酸序列分析，选取了HCVcAg的21-40aa、41-60aa、51-70aa、101-120aa、121-140aa五个保守氨基酸序列。利用这5个合成多肽免疫小鼠，成功制备与鉴定出可识别相应肽段(51.70aa没有诱导小鼠产生抗体，未能制备出相应的抗体)的57株单克隆抗体(mAbs)，并证实这些肽段的抗体结合位点为天然HCVcAg抗原表位。在57株mAbs中，46株mAbs可识别41-60aa、101-120aa及121-140aa多肽，揭示了3个新的HCVcAg抗原表位，在国际上尚属首次发现。研究还发现21-40aa、41-60aa、101-120aa三段多肽表位可以诱导动物产生高亲和力的抗体，更正了HCVcAg只有21-40aa一个抗原表位的认知，为采用双抗体夹心法检测HCVcAg提供了理论依据与关键试剂。
2、高灵敏可控信号放大系统
以往报道的的信号放大系统多是不可控的体系，一旦反应其信号就增强到最大，不能区分特异结合与非特异结合，从而出现严重的假阳性反应信号。本研究发明了两种用于免疫检测的可控信号放大系统(Controlled signal amplification system，Controlled-SAS)，其特征如下:
(1)免疫层析检测可控信号放大系统。该系统由纳米颗粒如EuNPs或AuNPs标记的靶抗原检测抗体、生物素标记的靶抗原捕获抗体和位于固相上的抗生物素抗体组成。样本中的靶抗原分子会与生物素标记的捕获抗体和纳米颗粒标记的检测抗体形成树枝状的免疫复合物，并被固相上的抗生物素抗体捕获，从而实现对靶抗原分子的高灵敏高特异性检测。纳米颗粒介导的检测信号被显著放大并与检测靶抗原浓度呈正相关。只有在靶抗原存在的情况下，信号放大系统方起作用。本研究基于免疫层析法(LFIA)的可控信号放大系统(Controlled-SAS)，证实检测血浆样品乙肝e抗原(HBeAg)的敏感性增加了9倍，为高灵敏检测类似抗原分子HCVcAg提供了参考。
(2)免疫固相检测可控信号放大系统。该系统由抗生物素抗体和辣根过氧化物酶(HRP)双分子修饰的纳米颗粒(如AuNPs)、生物素标记的靶抗原检测抗体和位于固相上的靶抗原捕获抗体组成。样本中的靶抗原分子与固相上的捕获抗体及生物素化的检测抗体结合，进而与纳米颗粒上的抗生物素抗体结合，间接实现纳米颗粒上的HRP对靶抗原的标记，催化底物显色指示靶抗原的存在。该可控信号放大系统解决了亲和素非特异反应的问题，与常规ELISA方法比较具有更高的灵敏性。
3、高灵敏可控信号放大系统免疫检测HCVcAg方法
(1)可控信号放大系统免疫层析荧光试纸条(Controlled-SAS LFIA)检测HCVcAg:以LFIA为基础，建立了一种高灵敏、高特异的HCVcAg免疫试纸条检测法。所制备的试纸条由样品垫、结合垫、硝酸纤维素(NC)膜、吸水纸及PVC底板组成。临床样品在检测前，首先对血浆或血清样本进行变性处理，然后再将生物素化捕获抗体和EuNPs标记的检测抗体添加到变性处理后的样品液中，对其中的HCVcAg进行充分捕获。将纳米颗粒标记的抗原-抗体复合物离心分离，然后再采用免疫层析法对该免疫复合物悬液进行检测。该方法检测HCVcAg的敏感性相当于qPCR检出HCV RNA105IU/mL的血浆样本。通过对41份献血者HCV RNA阳性血浆样本检测比较，该Controlled-SAS LFIA与商品化ELISA试剂盒对HCVcAg的检出率分别为53.7％与56.1％，差异不显著(P＞0.5)。结果表明，本研究建立的高灵敏免疫层析试纸条与常规ELISA方法的敏感性和检出率相同，且具有简便快速的优点，在丙型肝炎特异性快速诊断中具有较高实际应用价值。
(2)可控信号放大系统ELISA(Controlled-SAS ELISA)检测HcVcAg:
采用HCVcAg捕获单抗包被微孔板，与生物素化的检测抗体夹心检测血浆中HCVcAg靶抗原，最后通过抗生物素抗体和HRP双分子标记的AuNPs的可控信号放大系统，以HRP催化底物显色指示反应结果。实验针对血浆中HCVcA2多以免疫复合物形式存在的问题，研究确立了含5.5M尿素、5％Tween80、1％Triton X-100的样品处理液。经各环节及相关要素条件优化，研究建立了基于可控信号放大系统的新型AuNPs-SAS ELISA方法，用于79份HCV RNA阳性献血者血浆样品HCVcAg检测。与常规ELISA比较，Controlled-SAS ELISA反应敏感性提高了10倍，其检测HCVcAg阳性结果与HCv RNA阳性样品符合率为91.1％，而常规ELISA的检测符合率为55.7％，两种方法检出率差异非常显著(P＜0.01)。建立的可控AuNPs-ELISA方法克服了现行ELISA诊断方法的灵敏性低的技术缺陷，可用于献血者HCV感染筛查及临床诊断。
结论：
1、研究制备了HCV核心蛋白21-40aa、41-60aa、101-120aa、121-140aa多肽单克隆抗体，发现并证实这些肽段含HCVcAg抗原表位，可作为免疫诊断试剂检测的靶标，为HCVcAg检测产品的研发提供了理论依据和关键抗体试剂。
2、研究发明了一种新型的可控信号放大方法系统和一种双分子标记纳米颗粒的可控信号放大系统。这两个系统可以显著提高免疫学检测方法的灵敏性而不降低特异性，可应用于免疫层析检测试纸条或固相免疫检测方法。
3、研究选用制备的可识别HCVcAg多表位的单克隆抗体或多表位免疫血清抗体的夹心技术，建立了检测血浆或血清中HCVcAg靶抗原的高灵敏可控信号放大系统荧光试纸条及ELISA方法，可用于HCV感染献血者筛查及临床诊断。
创新性和意义:
(1)本研究在国际上首次系统分析与揭示了HCVcAg抗原表位。除己报道的21-40aa表位外，新发现了HCVcAg41-60aa、101-120aa、121-140aa肽段可以诱导产生特异性抗体，证实这三个多肽位点是HCVcAg的抗原表位，可作为免疫诊断的检测靶标。
(2)采用HCV核心蛋白21-40aa、41-60aa、101-120aa三个表位多肽表位免疫动物制备了一批高亲和力单克隆抗体，为研制双抗体夹心法检测HCVcAg诊断试剂盒的提供了关键材料。
(3)发明的高灵敏可控信号放大系统在保证特异性的同时，大幅度提高了免疫检测HCVcAg靶抗原的灵敏性，具有代替现有双抗体夹心免疫层析方法或ELISA的潜在应用前景。
(4)建立的高灵敏可控信号放大HCVcAg免疫检测方法，为其他类似靶抗原分子(诸如HBeAg等)免疫检测提供了重要参考依据。