中药质量评价中指标性成分的确定是中药质量标准研究的关键问题之一,目前大多数中药的指标性成分与安全性、有效性关联甚少,与临床价值严重脱节,因此创新和完善中药质量评价标准的需求日益迫切。菊花作为一种药食同源的中药被全世界广泛应用,由于基原多、成分复杂,菊花化学成分受到生长环境、产地、种质资源、采收期等各个环节的影响。为推进以临床为导向的中药质量评价体系发展,本研究以菊花的指标性成分筛选为核心,以成分与药效关联作为突破口,开展了基于成分-药效关联的菊花质量标准与评价研究。研究目的以菊花为例,形成了基原多、成分复杂中药品种质控指标成分确定的系统研究方法,建立一种基于成分与药效关联的菊花质量控制方法,形成客观反映中药质量内涵的多层级等级评价体系,推动中药质量标准向因药制宜、效用关联的评控方向转变,保证菊花质量可控,产品优质,临床有效,为中药行业可持续发展提供有力科技支撑。研究内容综述部分,从中药质量评价研究进展,菊花的品种、分类、药理作用、化学成分、传统功效与作用机理、质量评价现状等几方面进行阐述,表明菊花传统功效与抗炎作用存在较为密切的对应关系,为菊花基于药效的质量评价提供依据。实验部分开展了如下研究:1.菊花代谢组学研究。采用UPLC-Q-TOF-MS液质联用系统,全面分析了菊花的代谢成分。对27个不同品种的菊花鲜品进行研究,每一品种选择3种不同花期,全面定性表征菊花化学成分组,并以峰面积作为指标进行定量分析。运用主成分分析、聚类分析、方差分析、T-test检验等方法,寻找菊花共性指标成分,差异性指标成分,特征性指标成分。通过研究品种、采收期对成分的影响,筛选菊花稳定、可控的质量评价指标成分。建立一种准确、快速、高效的方法对菊花化学成分进行较为深入、全面的分析。2.基于化学基准和效应基准相结合的菊花质量评价指标成分筛选。基于文献研究确定抗炎作用是菊花临床的主要功效。在传统中医药理论指导下,围绕化学成分与抗炎活性的关联,展开如下研究:2.1采用虚拟技术,对菊花中成分进行与药效相关的预测和筛选。运用网络药理学分析菊花的抗炎作用机制及可能参与的炎症通路和潜在的活性成分。采用现代信息网络技术、分子对接技术、计算机辅助技术,将菊花中主要化合物与炎症因子进行分子对接。2.2菊花提取物的指纹图谱与多成分含量测定分析。结合化学模式识别法,筛选菊花质量评价指标成分。采用HPLC分析法对52个菊花提取物中13个指标性成分进行分析,运用中药色谱指纹图谱相似度评价系统,主成分分析、聚类分析、热图分析等化学模式识别方法,方差分析、T-test检验等统计方法,对不同品种、不同花期、不同提取方式的菊花提取物中13种指标性成分进行含量测定和比较研究,筛选适宜作为菊花质量评价的代表性指标成分。2.3通过药效学实验研究,筛选潜在的活性指标成分。采用体外细胞炎症模型进行药效学实验研究,通过PCR、Elisa等分子生物技术,方差分析、T-test检验等统计学方法,检测细胞活力,NO浓度,炎症因子TNF-α、IL-6、IL-1β、iNOS、COX-2、PGE2 mRNA表达水平,评价不同品种菊花抗炎活性差异。以菊花预测和拟定的指标成分含量作为自变量,炎症因子、炎性介质指标结果作为因变量,利用偏最小二乘回归分析法结合变量重要性投影得分、二值相关分析、回归分析等统计学方法,进行成分-药效的关联性分析,筛选菊花潜在的活性指标成分。3.建立一种基于化学成分-药效活性关联的菊花质量标准。以同类成分总量作为指标,运用一测多评法结合外标法作为菊花质量标准的测定方法。4.对市场上50批菊花进行综合性质量等级评价,并对来自49个厂家56批菊花的市场价格进行调研。运用中药饮片质量常数评价方法建立菊花等级评价标准。该标准是集形态特征和指标成分的综合性质量等级划分方法,并与生物活性关联,优于目前的商品规格等级评价方法。研究结果与结论菊花植物代谢组学研究,共鉴定菊花中咖啡酰基奎宁酸、黄酮、花青素、胡萝卜素、其他5大类成分,共计化合物73种。咖啡酰基奎宁酸和黄酮是菊花最主要的成分类别,菊花质量评价指标可从这两类中指认。共有代谢成分中,含量较高且品种间差异大的化合物,如咖啡酰基奎宁酸类中的4,5-DCQA等、黄酮类中的Acn等,这些成分适合作为菊花质量评价指标性成分的筛选对象。在菊花中含量较高且对菊花分类贡献度大的化合物:Lut(1),Acn等,适合作为菊花质量评价的指标性成分。其中4,5-DCQA等在大部分品种中含量较高,个别品种含量较低,适合作为菊花质量评价的定量指标性成分;3-CQA在所有样品中含量均高,且品种间差异小,适合作为菊花质量评价的定性指标性成分。菊花中含量低的代谢成分,不能代表菊花的化学特征,如1-CQA等以及花青素类,胡萝卜素类等认为不适合作为菊花质量评价的指标。采收期对于菊花鲜品中的各主要化合物含量影响较小,鲜品中同品种不同花期的化合物含量差异远小于品种间化合物含量差异。有些化合物有望成为特定品种潜在的标识性化合物,如3-CQA可鉴别麻城本地菊等。基于化学基准和效应基准的菊花成分指标筛选,检测到菊花提取物指标性成分13个,共性成分10个。含量高且稳定,随品种、花期、提取方法都变化较小的化合物可以作为菊花定性鉴别的指标,如3-CQA。含量高且品种间存在差异,认为可以作为菊花定量鉴别的指标,如:Lut-7-O-G、Api-7-O-G、Lut-7-O-β-G、Api-7-O-6-AG。含量高且品种间离散程度大,分类贡献度大的成分,可作为菊花品质优劣、品种鉴别的评价指标,如:3,5-DCQA、4,5-DCQA、3,4-DCQA、3-CQA、Api-7-O-6-AG。含量较低,品种间差异大如 Api、Dio、5-CQA、4-CQA、Acn,且在部分品种中未能检测出的成分如:Api、Acn,认为均不适合作为菊花质量评价的指标。所以从化学基准分析认为,3-CQA、3,5-DCQA、4,5-DCQA、3,4-DQA、Lut-7-O-G、Api-7-O-G、Lut-7-O-β-G、Api-7-O-6-AG 为菊花质量评价的核心指标成分。菊花提取物的聚类情况与传统菊花分类基本一致,说明传统分类与基于化学成分的分类存在相关性。采收期对成分存在一定影响,胎菊与全菊在成分组成上基本一致,但胎菊主要化合物含量均高于全菊。虚拟技术的指标预测和筛选表明,Lut-7-O-β-G、3,5-DCQA等与炎症靶点蛋白结合能力最强。网络药理学研究表明,菊花抗炎作用参与的通路中最主要的是PTGS等。药效学实验表明,菊花提取物对LPS诱导的RAW264.7炎症细胞模型的炎症反应具有较好的抑制作用:对炎性介质、炎症因子均有明显抑制作用。不同品种菊花的抗炎药效存在显著性差异。其中贡菊,特色品种#1表现出较强的炎症抑制作用,这与基于化学成分的质量评价结果一致。滁菊的抗炎作用较差,毫菊次之。菊花的活性成分对炎症因子COX-2和iNOS的调控作用最强。成分与药效关联结果表明,能够下调炎症因子mRNA表达的化合物可能为:1,3-DCQA、3,5-DCQA、Lut-7-O-β-G。抑制炎性介质释放量的化合物可能是3,5-DCQA、4,5-DCQA、3-CQA、Api。综合以上因素认为,菊花抗炎作用的活性成分可能是:3,5-DCQA、4,5-DCQA、Lut-7-O-β-G、1,3-DCQA、3-CQA 等,这些指标可以作为菊花质量评价的指标性成分。综合化学成分、活性筛选、药效关联的研究结果,最终确定基于成分-药效关联的菊花质量标准检测指标为:1,3-DCQA、3-CQA、Lut-7-O-G、3,5-DCQA、4,5-DCQA、Lut-7-O-β-G、1,5-DCQA。研究发现,1,3-DCQA 只存在于菊花水提取物中,是由1,5-DCQA经水加热回流转化而来,1,5-DCQA在菊花乙醇提取物中稳定,确定其转化是受温度影响。所以最终确定:3-CQA、Lut-7-O-G、3,5-DCQA、4,5-DCQA、Lut-7-O-β-G、1,5-DCQA 6 个指标成分作为菊花质量标准评价的指标成分。采用一测多评结合外标法,运用加和控制总量的计量方法,成功建立了一种新的菊花质量控制方法。该方法测定了菊花中的6种化合物,其成分的峰面积和浓度在测定浓度范围内均具有良好的线性关系,加样回收率、稳定性、精密度、重复性均符合标准,该方法简单、准确、经济、高效。该方法符合中药质量评价从单指标向多指标,从指标性成分向药效成分评控的发展方向,与2015版《中国药典》“菊花”项下含量测定标准相比:确定了 6个质控指标成分,较药典标准增加了 3个指标成分,且均与功效相关,增强了菊花质量控制的代表性和整体性;采用一测多评法结合外标法测定,运用同类别指标成分的总量作为评控指标,更加简便、经济、实用。可为药典标准的提升提供参考,为菊花的质量控制提供可行的分析手段。根据菊花等级评价结果,将市场上贡菊,杭菊,胎菊共50种菊花分为3个等级,分级结果表明等级与重量呈正相关,等级与内在指标成分含量呈正相关,等级越低,内在指标成分含量越低。该标准更加全面、准确的对菊花进行了等级评价,为中药质量等级评价体系建立提供了参考,对规范市场,提高菊花质量,引导优质优价,保证临床药效起到积极推动作用。