研究背景原发性肝细胞癌是世界范围内高发的恶性肿瘤之一，严重危害人类健康，目前临床上用于治疗肝癌的方法主要包括外科手术切除、射频消融、放化疗、肝脏移植、介入栓塞等，但由于肝癌具有起病隐匿、生长迅速、侵袭转移强等特点，存在治疗后易复发、预后较差的缺点,而导致治疗效果较差的主要原因是肿瘤发生了侵袭和转移，约占肝癌患者死亡原因的90%以上[1]。侵袭转移是恶性肿瘤的特征之一，表现为癌组织从上皮组织发展到恶性程度更高的肿瘤，反映在局部侵袭和远处转移。侵袭转移的第一个关键和必需环节是肿瘤细胞获得运动能力，侵入周围组织。目前的学术观点，将此环节生物学行为的改变称为上皮细胞间质化(EMT)，即上皮细胞形态上失去自身特性并向着间质细胞表型转变的现象,可以帮助肿瘤细胞获得并增强侵移能力，其在肿瘤细胞的侵袭转移发生过程中发挥了关键作用[2]，其中一个很重要的变化就是出现了由肌动蛋白（SMA）构成的侵袭性伪足，促进肿瘤细胞运动及脱离原发灶。因此，肿瘤细胞能够发生侵袭转移的关键分子就是肌动蛋白，以此为研究靶点就能够调控肝癌细胞的侵袭能力[2-4]。α-肌动蛋白（α-SMA）是高度保守的6型肌动蛋白的一种，主要功能与细胞运动、细胞形态的维持，骨架和伪足的构建密切相关。研究表明α-SMA表达升高的癌细胞具有间充质细胞的特征，是癌细胞侵袭力或上皮细胞间质化的标志，α-SMA是肿瘤细胞的运动和侵袭转移的直接施行者，α-SMA的表达与患者预后相关[5,6,7]。α-SMA的聚合受到Arp2/3复合体、切丝蛋白和肌球蛋白轻链磷酸酶（MLCP）磷酸化相互配合的调控，进而调控细胞运动。此过程受Rho家族的三条信号（Rho/RhoA、Rho/Cdc4和Rho/Racl）通路的调控，三条通路之间存在信号交叉,形成复杂的信号网络，因此很难仅从某一条信号通路方面找到有效靶点进行干预。研究如何调控α-SMA是抑制肝癌细胞侵袭转移的关键。长链非编码RNA（long non-coding RNA，lncRNA）是指长度超过200nt的非编码RNA，一直被认为是基因转录的副产物，无生物学功能。近年来发现lncRNA也是基因调控网络中的关键成员，在染色质重塑和基因转录及转录后的调控中均发挥了强大的基因调节功能[8,9]。大部分蛋白编码基因都能找到一个或数个相应调控功能的lncRNA[10,11]，因此我们推测从lncRNA水平对α-SMA进行调控，可能找到抑制肝癌侵袭转移的新靶点。目前关于lncRNA分子在肝癌调控机制中的研究十分有限，目前研究发现的与肝癌相关的lncRNA有H19、母系表达基因3（materally expressed gene3,MEG3）、移植相关肺腺癌转录本1（metastasis-associated lungadenocarcinoma transcript1,MALAT1）、肝癌高表达基因（highlyup-regulated in liver cancer,HULC）等[12,13]。H19不但能被致癌转录因子直接激活，还可通过抑制转录激活因子和抑癌基因从而引起肿瘤的发生。MALAT1高表达与肝癌的高度转移风险以及不良预后同样密切相关，通过RNA干扰技术和RNA短发夹结构干预MALAT1的高表达,能够在转录、转录后水平抑制肿瘤细胞的体外增殖和侵袭力，而MALAT1通过调节参与RNA剪接的丝氨酸/精氨酸（Serine/argine,SR）蛋白活性，调控转录后的选择性剪接。HOTAIR (HOXantisense intergenic RNA, H0TAIR)不仅能影响肿瘤发生，还与肿瘤的转移关系密切，高水平的HOTAIR表达意味着肿瘤的高转移率和患者的低生存率，HOTAIR的表达上调介导多梳蛋白抑制性复合物2（polycomb repressive complex2,PRC2）与靶点的结合，并作为转录沉默因子的辅抑制物，阻止肿瘤转移抑制基因的转录，增加肿瘤转移的风险[14,15]。因此如果发现一条靶分子为α-SMA的lncRNA，理论上就有通过其调控α-SMA的表达影响肝癌的侵袭转移机制的可能，改变肝癌细胞的生物学行为，降低发生灶外侵袭转移的风险，对改善患者的疗效和预后有着积极的意义。在前期试验中，我们发现了一条在肝癌中表达明显升高的新的lncRNA分子：UC001kfo(AX748062)，长度为2043bp，其基因编码区与α-SMA的编码基因ACTA2发生部分重叠， ACTA2的启动子就被包含在重叠区域中，且UC001kfo与ACTA2有两段长度分别为545bp和359bp的互补序列，应用基因组浏览器和RNAplex进行靶基因的预测显示UC001kfo的靶分子为α-SMA[16,17]，进一步研究发现UC001kfo和α-SMA在肝癌组织中表达显著性升高，并且在高侵袭性肝癌细胞中表达量高于低侵袭性肝癌，在肝癌门静脉转移组及低分化肝癌组中UC001kfo的表达也显著性升高[18]，用RNA干扰技术（RNAi）下调UC001kfo的表达后，细胞的运动及侵袭能力明显降低[19]。所有前期实验均提示：UC001kfo可以影响肝癌细胞的侵袭转移，并极有可能是通过调控α-SMA的表达促进肝癌细胞的侵袭转移。目的研究lncRNA-UC001kfo对人肝癌细胞株Bel-7402的侵袭能力的影响，为进一步确认UC001kfo通过调控α-SMA参与肝癌侵袭机制的研究奠定基础，确保后续实验设计的可行性和可靠性。方法1. pcDNA3.1-UC001kfo载体的构建及鉴定（1）提取Bel-7402细胞的总RNA,经逆转录反应获得cDNA。（2）根据UC001kfo的序列设计含有双切酶位点的引物后进行PCR扩增。（3）双切酶分别处理pcDNA3.1和PCR扩增产物。（4）制备DH-5α大肠杆菌感受态细胞，配制连接液并进行转化，抽取出pcDNA3.1-UC001kfo。（5）对pcDNA3.1-UC001kfo进行双酶切鉴定，并进行PCR测序分析。2.转染人肝癌细胞株Bel-7402采用脂质体转染技术分别将pcDNA3.1和将pcDNA3.1-UC001kfo转染入Bel-7420细胞内，组成空载体组（转染pcDNA3.1）和实验组（转染pcDNA3.1-UC001kfo）进行后续实验。3.实验分组及结果将实验分为3组：空白组（无转染）、空载体组（转染pcDNA3.1）、实验组（转染pcDNA3.1-UC001kfo），48h后应用RT-PCR技术分别定量检测3组细胞中UC001kfo的表达含量，Trans-well小池试验检测3组细胞的侵袭能力，对数据进行统计学处理、并分析结果。4.统计学处理采用SPSS17.0统计软件包进行分析处理，定量资料表示为均数±标准差（X±S），两组定量资料比较采用t检验，以α=0.05作为检验水准。结果1RT-PCR定量检测UC001kfo的结果及分析以β-actin表达量作为内参对比，结果显示：空白组、空载体组和实验组的UC001kfo表达量分别为1.00±0.069、0.94±0.070、1.38±0.082，运用t-test对结果进行分析后发现：空白组和空载体组比较，差异无明显统计学意义（P>0.05）；实验组UC001kfo的表达量明显高于空白组和空载体组，差异有明显的统计学意义（P<0.05）。2Transwell小池试验检测细胞侵袭能力统计计数显示：空白组、空载体组和实验组的穿膜细胞数分别为(122±7.54）、(149.33±8.04）和(214±22.67），运用t-test对结果进行分析后发现：实验组穿膜细胞数较空白组和空载体组均明显增多，差异具有统计学意义（p<0.05）。结论1.与空白组和空载体组相比，实验组的UC001kfo的表达量显著升高、侵袭能力显著增强。2.UCOO1kfo的过表达可以增强肝癌细胞的侵袭能力。