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猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)是影响世界养猪业重要病原之一,并造成重大经济损失,目前商品化疫苗尚不十分理想。先天性免疫反应是机体抵抗病毒感染的第一道防线,而抑制先天性免疫反应是PRRSV调控宿主免疫应答的重要因素。此外,PRRSV基因组高度变异,并可在机体内持续感染。深入了解PRRSV与机体先天性免疫反应之间的相互作用,并筛选有效的抗病毒蛋白,阐明其抑制病毒复制的机制,对研究该病新的防控技术具有重要作用。本研究主要内容包括以下3个部分:1.Mx2蛋白对PRRSV复制的影响及其关键功能区域解析Mx2是一种新的干扰素诱导蛋白,具有抑制病毒复制的作用,但Mx2在PRRSV复制过程中的作用尚不清楚。本研究从IFN-β刺激后的Marc-145细胞中克隆并扩增出全长猴Mx2基因(mMx2),发现过表达mMx2能够抑制PRRSV复制。IFN-β以剂量依赖关系诱导mMx2表达并抑制PRRSV复制,干扰mMx2基因后能够减少IFN-β介导的抗病毒活性。激光共聚焦和免疫共沉淀试验结果表明,PRRSV感染细胞中,mMx2能够与PRRSV N蛋白存在相互作用。通过mMx2截断体以及突变体的构建和表达,发现GTPase活性区域是mMx2抗病毒作用的重要区域,为PRRSV新型抗病毒药物研究奠定了重要基础。2.猪Mx2蛋白N端第62位氨基酸是其抑制PRRSV复制的关键位点猪源Mx2(pMx2)和猴源Mx2基因同源性仅为78%,pMx2对PRRSV的复制作用尚不清楚。本研究从IFN-β刺激后的猪外周血单核细胞(PBMC)中成功克隆并扩增出全长pMx2基因,过表达pMx2可有效抑制PRRSV复制。根据pMx2结构特点,构建了不同大小的pMx2截断体,发现pMx2 N末端60-64aa是介导其抗病毒活性的功能区域。对pMx2 N末端60-64aa进行基因定点突变,发现62aa(Met)是pMx2发挥抗病毒活性的关键位点。激光共聚焦及免疫共沉淀试验结果表明,PRRSV感染的细胞中pMx2与PRRSVN蛋白存在相互作用,不同活性的pMx2截断体及突变体在细胞内形态分布相同,并均可与N蛋白相互作用。此外,pMx2对不同类型PRRSV毒株均具有抑制活性。以上研究结果表明,N末端62aa(Met)是pMx2发挥抗病毒活性的关键功能位点。pMx2与N蛋白存在相互作用,但pMx2与N蛋白的结合域与pMx2抗PRRSV复制的关键位点62aa(Met)无关。3.趋化因子CXCL12在PRRSV复制中的作用趋化因子是机体调节先天性免疫以及适应性免疫应答的重要因子。趋化因子的分泌是机体抵抗病毒感染的一种重要机制,但PRRSV与趋化因子之间的相互作用尚不十分清楚。本研究发现两个不同毒力PRRSV毒株均可显著诱导Marc-145细胞中CXCL12(mCXCL12)的表达。PRRSV 可通过 MAPK(P38)和 NF-κB 通路诱导 mCXCL12上调,而PRRSV非结构蛋白Nsp12可介导mCXCL12上调。从Marc-145细胞中克隆全长mCXCL12基因,采用真核表达系统过表达mCXCL12,证明其能够有效抑制PRRSV复制。采用RNA干扰方法干扰细胞中内源性mCXCL12也可显著提高PRRSV复制。同时,猪源CXCL12(pCXCL12)也可有效抑制PRRSV复制。综上所述,干扰素诱导的Mx2蛋白和趋化因子CXCL12对PRRSV复制具有明显抑制作用,对PRRSV防控具有重要的理论意义和应用前景。