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嵌合抗原受体CAR-T细胞疗法对血液系统恶性肿瘤有疗效,但肿瘤控制并不持续长效。嵌合抗原受体技术是利用基因编辑技术,将人工设计的嵌合抗原受体Chimeric antigen receptor（CAR）表达在免疫细胞膜上,使T细胞的活化不受MHC限制和第2信号的限制,从而发挥强大杀伤作用。CAR-T细胞药物的疗效受多因素限制（高密度抗原、肿瘤微环境、T细胞耗竭导致T细胞功能失调等）。前期课题组已成功在脐带血来源的T细胞上表达CAR分子,制备获得靶向CD19的CAR-T细胞。为了有效提高CAR-T细胞的扩增能力与持久性,本研究我们将外源性c-Jun基因片段与CD19.CAR基因同时导入T细胞完成基因修饰,制备c-Jun转录因子过表达的CD19.CAR-T细胞,并研究c-Jun过表达对脐血CAR-T细胞活性的影响。目的:本文旨在探讨c-Jun修饰对CAR19脐带血T细胞功能作用的影响;为进一步开展经c-Jun修饰联合通用型CAR-T细胞研究提供基础理论依据。方法:通过PCR扩增c-Jun基因片段,将c-Jun基因片段通过infusion无缝连接技术克隆入线性质粒pHAGE-SFFV中。经慢病毒包装,制备、超滤管超滤浓缩病毒以获得高滴度病毒浓缩液。采集健康人脐带血细胞,经Ficoll分离液获得脐血单个核细胞（Cord Blood Mononuclear Cells,CBMC）后;用Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28磁珠抗体与CBMC共孵育,使T细胞充分活化。经CD4-Microbeads和CD8-Microbeads分选纯化脐带血T细胞。以慢病毒为载体按转导复数（multiplicity of infection,MOI）20将pHAGE-SFFV-CAR19与pHAGE-SFFV-Jun共转染人脐带血T淋巴细胞,流式细胞术检测脐带血T淋巴细胞表达CAR分子与c-Jun分子的情况。将两组CAR-T细胞培养15d;对比转导不同病毒的两组细胞的增殖情况。于10d将两组CAR-T细胞分别按效靶比1:1、1:0.3、1:0.1与本实验室构建的靶细胞模型:敲除人类白细胞抗原I（HLA-I）和人类白细胞抗原II（HLA-II）类基因的CD19+Namalwa-DKO靶细胞共培养,于4h检测CAR-T细胞表面CD107a表达情况;于24h检测靶细胞杀伤情况;同时收集细胞上清用酶联免疫吸附实验（ELISA,Enzyme Linked Immunosorbent Assay）测定细胞因子IL-2（Interleukin-2）、干扰素-γ（Interferon-γ）的分泌。监测干细胞样中央记忆性T细胞（Stem Memory T cells,Tscm）的比例。通过以上实验评估两组CAR-T细胞的抗肿瘤活性。结果:我们成功构建重组质粒pHAGE-SFFV-Jun慢病毒载体,将该载体在293FT细胞中包装生产慢病毒颗粒。使用经Ficoll分离、CD4-Microbeads和CD8-Microbeads分选后获得纯化脐带血T细胞。T细胞经Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28包被抗体活化48h后,pHAGE-SFFV-Jun与pHAGE-SFFV-CAR19慢病毒颗粒感染健康人脐带血T淋巴细胞。当MOI=20时,我们发现,同时转导pHAGE-SFFV-Jun与pHAGE-SFFV-CAR19病毒,与有且仅转导pHAGE-SFFV-CAR19病毒的CD3+T细胞转导率均在60%以上。CD19.CAR-T组的CD3+、CD4+、CD8+T细胞CAR19表达率分别是77.7%±1.0%、83.9%±3.4%、62.9%±2.5%;JUN-CD19.CAR-T组的CD3+、CD4+、CD8+T细胞CAR19表达率分别是63.6%±2.4%、72.4%±1.6%、41.4%±6.9%。JUN-CD19.CAR-T组的T细胞c-Jun表达率均达75%以上;CD3+T细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞分别为85.1%±1.9%、88.3%±4.2%、75.7%±2.9%。同时成功转导CAR19与c-Jun病毒的T细胞比例高达60%±1.9%。结果显示我们通过慢病毒颗粒成功地将目的c-Jun基因与CAR19基因转导至T细胞,并且获得了足够高的转导效率。经慢病毒转导后培养至15日,CD19.CAR-T组CAR19转导率降至47.5%±0.8%;而JUN-CD19.CAR-T组CAR19转导率65.7%±2.0%;表明成功转导c-Jun基因的T细胞有助于CAR19基因稳定且持久的表达。同时转导c-Jun与CAR19病毒的人脐带血CD4+T、CD8+T细胞增殖能力显著高于CD19.CAR-T组。且未转导病毒组与CD19.CAR-T组CD4+T细胞于11d不再继续增殖,CD8+T细胞于13d不再继续增殖;JUN-CD19.CAR-T组增殖至15d。同时转导c-Jun与CAR19病毒的JUN-CD19.CAR-T组其CD4+/CD8+高于CD19.CAR-T组与CBT组;提示c-Jun病毒的成功转导CAR19-T对CD4+T的增殖效果强于CD8+T细胞;说明人脐带血T细胞经c-Jun基因修饰后会改变CD4+和CD8+亚群分布。将JUN-CD19.CAR-T组和CD19.CAR-T组细胞分别与Namalwa-DKO CD19阳性细胞以不同效靶比1:1,1:0.3,1:0.1共孵育4h后,流式检测显示:不同效靶比下,JUN-CD19.CAR-T组CD107a表达高于CD19.CAR-T组,差异有统计学意义（P<0.05）。24h后,JUN-CD19.CAR-T组杀伤率分别为83%、89%、85%;CD19.CAR-T组杀伤率分别为67%、82%、80%。而阴性对照T细胞组的杀伤率仅有22%、45%、10%。JUN-CD19.CAR-T组与CD19.CAR-T组差异不显著。流式检测两组细胞记忆性相关分子的表达。JUN-CD19.CAR-T组T细胞的效应相关分子比例高于CD19.CAR-T组T细胞,提示该组T细胞具有更高的效应功能,效应细胞分化增强。ELISA检测JUN-CD19.CAR-T组、CD19.CAR-T组分别与CD19+靶细胞Namalwa-DKO细胞共培养24h后细胞因子IFN-γ、IL-2分泌情况。结果发现,3:1与1:0.3效靶比下,与CD19+靶细胞Namalwa-DKO共培养,JUN-CD19.CAR-T组IFN-γ的分泌显著高于CD19.CAR-T组（P<0.0001）;1:1效靶比下,差异显著（P<0.01）。而IL-2的分泌无统计学差异;与X-vivo.15完全培养基中含有IL-2密切相关。结论:转导c-Jun基因后的CAR-CBT细胞,过表达c-Jun,可增强脐带血来源的CD19.CAR-CBT细胞长期增殖能力,特别是CD4+T细胞;且具有更高效应功能,分泌更多IFN-γ等细胞因子,增强控制靶细胞生长的能力,更好得发挥抗肿瘤作用。