本论文研究动物共生菌的多样性及宿主-微生物相互作用关系。以传统中药昆虫中华真地鳖(药用名:土元)为模型研究其肠道共生菌的多样性;以夏威夷短尾鱿鱼为模型鉴定了鱿鱼宿主两个密切相关的杀菌通透性增加蛋白EsBPI2和EsBPI4在其共生关系中的作用。动物共生菌多样性研究是基于可培养和高通量测序技术探索土元肠道共生菌的群落结构和多样性。从土元雌成虫肠道分离获得224个菌株,对它们的16SrDNA进行包括ARDRA、RFLP和Eric-PCR的指纹图谱分析,结果显示其遗传多样性丰富。挑选了 71株菌进行16S rRNA基因测序分析,对分离得到的可培养菌进行分类鉴定和系统发育分析。它们归属于10个属,分别是芽孢杆菌属(Bacillus)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、乳杆菌属(Loctobacillus)、链霉菌属(Streptomyces)、假单胞菌属(Pseudomonas)、普罗维威登斯菌属(Providencia)、柠檬酸杆菌属(Citrobacter)、假枸機酸杆菌属(Psecdocitrobacter)、肠杆菌属(Enterobacter)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)。在代表菌株中,芽孢杆菌属为优势菌群,占比33%,其次为假单胞菌属和柠檬酸杆菌属,分别占比20%和18%。基于lllumina Miseq平台的高通量测序技术对土元卵鞘、若虫肠道和成虫肠道的细菌及古菌的16S rRNA基因可变V4区进行高通量测序分析,揭示各样品中的细菌和古菌群落结构及多样性。结果显示,细菌丰度在土元肠道样品明显高于卵鞘样品,在若虫肠道高于成虫肠道;古菌丰度在若虫和成虫肠道未检测到显著性差异。肠道细菌的多样性很丰富(香农指数>9.15,辛普森指数>0.98),明显高于卵鞘细菌的多样性(香农指数=4.84,辛普森指数=0.73)。土元卵鞘和肠道样品的细菌归属于12个门,24个纲,39个目,60个科,71个属。其主要优势菌群为拟杆菌门(Bactcroidetes)、厚壁菌门(Firmicutes)和变形菌门(Proteobacteria),占比都>22%。肠道样品的古菌归属于3个门,7个纲,8个目,11个科和13个属。其中甲烷杆菌科下的第Ⅱ属甲烷短杆菌属(Methanobrevibacter)占比高达45.0%,为第一大优势类群。测序结果显示,土元肠道共生菌多样性丰富。其中Phascolarcobacterium、Clostridium和Bacteroides等被确定为人体肠道“功能性核心类群”的菌属,在土元肠道也存在。在土元若虫和成虫肠道存在的细菌类群多数也在卵鞘中有发现,但也有些仅存于土元肠道。用古菌通用引物在土元卵鞘中未检测到PCR扩增条带,但在细菌通用引物扩增的PCR产物高通量测序中,卵鞘样品中仍然检测到少量的古菌(占比2.2%)。由此,可推测土元肠道的共生菌类群可能由亲代垂直传播和环境横向传播共同决定,受各种内在和外在因素的影响,并与宿主共同进化演变。肠道样品间总体相似度较高的同时又存在个体差异,可见,肠道共生菌因宿主生命阶段变化和个体差异而动态波动。宿主-微生物相互作用关系研究是通过RNA测序数据得到鱿鱼宿主的两种结构非常相似的杀菌/通透性增加蛋白EsBPI2和EsBPI4的基因序列,并对这两种蛋白质进行鉴定和功能验证。这两种密切相关的蛋白质分子,具有其它动物杀菌通透性增加蛋白的典型特征,其系统发育地位嵌套在其它无脊椎动物的杀菌通透性增加蛋白中。亲和纯化的EsBPI2和EsBPI4对定殖在鱿鱼发光器隐窝上皮细胞的费氏弧菌有强效的抗菌活性。这两种蛋白质通过热处理和与各自特异性抗体结合后失去活性。共生费氏弧菌定殖过程处在酸性环境中,为模拟这一过程,将费氏弧菌在酸性环境中预处理后,发现其对蛋白质抗菌活性的耐受力增强。免疫细胞化学分析定位到幼年鱿鱼的这两种蛋白EsBPI2和EsBPI4不仅分布在共生的器官,也分布在直接接触环境海水的其它上皮表面。这两种蛋白质在细胞内的分布存在差异:EsBPI4仅分布于上皮细胞;而EsBPI2除了分布在上皮细胞,也存在于血液和用于促进幼体孵化的瞬态器官中。幼体孵出后,随着这个器官的退化,位于其中的EsBPI2也逐渐消失。这些结果证明这两种BPI在鱿鱼孵出的初期就开始发挥不同的防御作用,调节与共生菌的相互作用并保护宿主组织免受环境细菌的定殖。这项研究发现了杀菌/通透性增加蛋白的新功能,具体包括海洋动物可以抗拒环境中不可控的浮游细菌污染的生化机制和互利共生关系中的一种调制作用。