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研究背景:幽门螺杆菌(Helicobacterpylori,Hp)的发现已彻底地颠覆了人类关于许多种胃肠道疾病的基本理论,使某些胃肠道疾病如慢性、活动性胃炎和消化性溃疡的病因学和治疗学上出现了一场革命,Hp且与胃腺癌和胃粘膜相关性淋巴样组织淋巴瘤(MALT)密切相关,1994年世界卫生组织(WHO)/国际癌症研究机构(IARC)已将Hp列为Ⅰ类致癌因子。目前,已发现Hp的毒力因子有多种,其中细胞毒素相关蛋白(cytotoxinassociatedantigen,CagA)、细胞空泡毒素(vacuolatingcytotoxin,VacA)与Hp致病性有关,也是目前Hp的研究热点。
根除Hp在上述消化道疾病中具有十分重要的意义,但目前根除Hp的治疗方案服药次数多、剂量大,单剂药物根除率低,而使用多联药物费用昂贵、治愈率不高且不能有效阻止Hp的再感染和复发,且耐药菌株的增加也使抗Hp治疗面临越来越复杂的难题。
虽然Hp全菌疫苗有效,特别是在治疗方面具有优势,但有潜在的安全性问题;亚单位疫苗成分明确,具有较好的安全性,但需要安全而强效的粘膜佐剂,要给予足够高的剂量发挥佐剂效力,且不能完全避免腹泻等副作用。虽然有关构建重组疫苗已经做了许多工作,但重组疫苗难以在同一宿主中表达多个抗原,而且很难保证在定居后能稳定表达所有抗原。还有一个危险是机体可能产生针对载体的免疫应答,而预先存在的免疫可以阻止疫苗株的定居。虽然对Hp免疫预防已进行了大量研究并取得了令人瞩目的成果,但仍有大量问需急待解决。
本研究依据RNAi技术原理,国际标准HpNCTC11637菌株和HpNCTC11639菌株为研究对象,设计针对vacA和cagA基因的siRNA片段,观察靶向siRNA能否抑制HpvacA和cagA基因表达并观察Hp培养超滤液对人胃黏膜上皮细胞株(GES-1)的影响。
第一部分:siRNA抑制HpvacA和cagA基因表达体外实验
目的:优化Hp的电转化条件,观察siRNA能否抑制HpvacA和cagA基因表达。
结论:体外实验中,Hp电转化效率与电场强度和脉冲持续时间关系密切;siRNA特异抑制HpvacA和cagA基因表达,且与浓度和时间有关。
第二部分:Hp培养超滤液对GES-1的影响
目的:观察Hp超滤液对GES-1细胞的空泡毒作用和对其增殖、调亡的影响。
结论:体外实验中,Hp超滤液对GES-1细胞有空泡毒作用,且与Hp超滤液浓度有关;siRNA抑制vacA和cagA表达使Hp超滤液对GES-1细胞空泡毒作用消失;Hp超滤液既促进GES-1细胞凋亡,又促进其增殖。