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食管癌是我国常见的恶性肿瘤之一。2018年中国癌症报告显示,食管癌发病率和死亡率在我国癌症中分居第六位和第四位。食管癌有两种病理类型:食管鳞癌与食管腺癌。在我国,90%以上的食管癌为食管鳞癌。尽管诊疗技术有所发展,但食管鳞癌发病隐匿,进展迅速,其五年生存率仅为10-30%。因此,揭示食管癌发生发展的分子机制,寻找潜在诊断标志物与治疗靶点,研发新的治疗药物是我国肿瘤研究领域的重要工作。Ras-相关结构域家族蛋白6(RASSF6)是Ras相关结构域蛋白家族中的一员。RASSF6基因启动子区的高甲基化,导致其在结肠癌、乳腺癌及黑色素瘤等肿瘤中表达显著下调,可通过影响FAK、Hippo等信号通路调控肿瘤的生长与凋亡。本课题组食管鳞癌转录组测序数据显示,RASSF6在食管鳞癌中表达异常上调,这提示RASSF6在食管鳞癌中有着不同于其他癌种的作用机制。因此,我们以RASSF6为研究对象,深入探讨RASSF6的异常表达在食管鳞癌发生发展中的功能与机制。在本研究中,我们首先在43对食管鳞癌组织中检测RASSF6的表达,结果显示RASSF6在食管鳞癌组织中的mRNA及蛋白表达水平显著高于癌旁组织。随后对84对食管鳞癌组织进行免疫组化染色,发现RASSF6在食管鳞癌组织中表达上调,而且它的异常高表达与食管鳞癌患者的不良预后显著相关。CoBRA实验表明,在食管鳞癌中RASSF6启动子区未发生显著的甲基化。体外功能实验显示,过表达RASSF6可促进食管鳞癌细胞的增殖、克隆形成以及侵袭迁移能力,而敲降RASSF6可抑制食管鳞癌细胞的增殖、克隆形成、侵袭迁移能力,并导致细胞周期G1/S期的阻滞。动物实验表明,敲降RASSF6后,食管鳞癌细胞皮下成瘤以及肺转移能力显著减弱。我们通过免疫共沉淀联合质谱技术发现,RASSF6可与抑癌基因TRIM16结合。进一步研究表明,RASSF6可通过结合TRIM16促进其泛素化过程,从而影响TRIM16蛋白的稳定性。机制研究发现,RASSF6可通过调控TRIM16影响Cyclin D1和Snail的表达,促进食管鳞癌细胞的增殖与侵袭迁移。同时,TRIM16可部分回复RASSF6对食管鳞癌恶性表型的影响。综上所述,本课题首次发现RASSF6在食管鳞癌中异常高表达,RASSF6可通过结合TRIM16影响其稳定性促进食管鳞癌的发生发展,为食管鳞癌的诊治提供了新的思路。近年来研究发现,在基因组发生转录的基因中,编码蛋白质的RNA仅占3%左右,其余的均以RNA的形式发挥功能,这提示非编码RNA在人体的生理过程中发挥重要作用。食管癌发病机制不清,缺乏有效的诊断标志物和治疗靶点。过去的研究多集中于蛋白在食管癌发生发展中的作用,非编码RNA在食管癌中的作用及分子机制尚不明确。长链非编码RNA(long non coding RNA,LncRNA)是一类由RNA聚合酶Ⅱ转录、长度大于200nt,无蛋白编码能力的非编码RNA。其种类繁多,具有丰富的二级结构,表达具有较强的组织特异性。LncRNA可以通过自身的折叠或结合染色质、RNA及蛋白等方式,在多个水平调控基因的表达,影响肿瘤的恶性增殖、转移、代谢和凋亡等。本课题组前期对91例食管鳞癌及配对的癌旁组织进行转录组测序数据显示,LncRNA-581在食管鳞癌组织中表达上调;在独立于转录组测序样本的另外85例食管癌组织及癌旁配对组织进行qPCR,结果显示,LncRNA-581在食管鳞癌组织中高表达;UCSC数据库显示,LncRNA-581在食管癌中表达上调,物种之间的保守性较差,不具有蛋白编码能力。然而LncRNA-581在肿瘤中的功能与作用机制尚未见报道。我们通过RACE及Northern Blot实验鉴定了 LncRNA-581在食管鳞癌中的全长是668nt。核浆分提实验表明LncRNA-581定位于细胞浆。细胞功能实验显示,LncRNA-581促进食管鳞癌细胞的增殖、克隆形成以及侵袭迁移。构建LncRNA-581稳定低表达的食管癌细胞系,发现敲降LncRNA-581后,食管鳞癌细胞体内成瘤能力减弱。初步机制研究发现,LncRNA-581可以结合并影响防御素HNP-1的表达,进而影响单核细胞向M1型巨噬细胞的极化过程。以上研究表明,LncRNA-581在食管鳞癌中的表达上调,可结合并影响HNP-1的表达,影响单核细胞向巨噬细胞极化,进而促进食管鳞癌的恶性进程。我们后续将会进一步探究LncRNA-581对食管鳞癌细胞免疫逃逸的影响。